丙二醛含量测定学习资料

1、丙二醛含量测定植物组织中丙二醛含量测定方法一：一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜 脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。 测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4 二酮），三甲川最大的吸收波长在 532nm但是测定植物组织中 MDA寸受多 种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的 最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物

2、遭受干旱、高温、低温 等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应 产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖 或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代 巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100 300pgg1Dw根据植物样品量和提取液的体积，加入 Fe3+的终浓度为0.5nm ol L S在532nm 600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含 量。三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植

3、物叶片。2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试 管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂：10%三氯乙酸；0.6 %硫代巴比妥酸（TBA溶液：石英砂。四、实验步骤1. 丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片 1g,加入少量石英砂和1 0%三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10%三氯乙酸进一步研磨，匀浆以 40 00r/min离心10min,其上清液为丙二醛提取液。2. 显色反应及测定取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6 %硫代巴比妥

4、酸溶液。摇匀，混 合液在沸水浴中反应15min,迅速冷却后再离心。取上清液分别在 532、600和 450nm波长下测定吸光度（A）值。五、丙二醛含量计算：由于蔗糖TBA反应产物的最大吸收波长为450nm毫摩尔吸收系数为85. 4X103，MD TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是 7.4 X10 3和155 X103。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组:A 450= (85.4 X1O_3) C糖(A2 Aoo) = (155X10_3) CMd+ (7.4 X10_3) C

5、糖解得：A450C糖=11.71A 450 (mmolL)85.4 X1031CMd= 6.45 (A32 A500) 0.56A450- (mol L )公式中：A450在450nm波长下测得的吸光度值A532在532nm波长下测得的吸光度值A600在600nm波长下测得的吸光度值5* 1.55 X10为摩尔比吸收系数C糖、CMda分别是反应混合液中可溶性糖、MDA勺浓度1.按下式计算提取液中MDA浓度反应液体积(ml)CmdaX1000提取液中MDA浓度(mol ml1)=测定时提取液用量(ml)2.按下式计算样品中MDA含量提取液中MDA度(ymol ml1)X提取液总量(ml)MDA含

6、量(mol g1 Fw)植物组织鲜重(g)方法二:一、原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以 与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5，5-三甲基恶唑- 2，4。二酮），其最大吸收波长在 532nm 。测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性 糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，但532nm处 也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因 此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干 扰。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片（二）仪器设备：紫外可见分光光度计1台

7、；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。(三) 试剂：10 %三氯乙酸(TCA)；0 6 %硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol -1)溶解，再用10 %的三氯 乙酸定容；三、实验步骤1 实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。2 . MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2mll0 % TCA和少量石英砂，研磨 至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在 4000r min-1离心10min，上清 液为样品提取液。3 .显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml

8、0. 6 % TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应 15min，迅速冷却后再离心。取上清 液测定532、600和450nm波长下的消光度。4 .计算含量(1)直线方程法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(0-25mmolL-1)与TBA显色反应产物在450nm 的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与 TBA显色反应 后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在 532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532 = -0 . 00198 十 0 . 088D450(1)(2

9、)双组分分光光度法据朗伯一比尔定律：D = kCL,当液层厚度为1cm时，kD/C, k称为该物质 的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于 此混合液在该波长下各显色物质消光度之和。已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别 为85 . 40、7 . 40。MDA在450nm 波长下无吸收，故该波长的比吸收系数 为0 , 532nm波长下的比吸 系数为155，根据双组分分光度计法建立方程 组，求解方程得计算公式：式中C1 = 11 . 71D450(2)C2 = 6 . 45(D532-D600)-0.56D450(3)C1-可溶性糖的浓度(mmol L-1)，C2-MDA 的浓度(umol L-1 )，D450、0532、D600分别代表450、532和600nm 波长下的消光度值。以直线方程法计算时，按公式(1)求出样品中糖分在532nm处的消光度值 Y532，用实测532nm的消光度值减去6nm非特异吸收的消光度值再减去 Y532，其差值为测定样品中 MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按 MDA在532nm处的毫摩尔消光系