杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制探究

1、杨梅素抗肝肿瘤细胞hepg2作用及其机制探摘要目的 探讨杨梅素对肝癌细胞hepg2的生长抑制 和诱导凋亡作用及其作用机制。方法 应用甲基喙哇蓝(mtt)比色法，测定杨梅素对hepg2细胞株活性的影响， 检测其抑制hepg2细胞株的时间效应和剂量效应；应用形态 学观察、he染色和annexin v-pi流式检测，测定杨梅素对 hepg2细胞的凋亡作用，并进行细胞周期的分析，最后对杨 梅素对细胞凋亡相关的蛋白p34cdc-2、cyclin bl. bcl-2 和parp的影响进行了研究。 结果 杨梅素对hepg2细胞 具有生长抑制及诱导凋亡作用，且呈时间依赖和剂量依赖 性，表现为：细胞g2/m期阻

2、滞，出现明显的凋亡峰；bliss 法测定杨梅素对hepg2细胞的ic50值为(32. 18±2. 31) umol/l, 30、50 umol/l杨梅素对g2/m期细胞比率分别 为(41.32±0, 90) %和(80. 07±0. 90) %,差异有统计学意 义(p <0. 05)； p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而cyclinbl蛋白的表达量明显上升,bcl-2蛋白的表达量锐减, 并诱导半胱氨酸蛋白酶caspase-3的底物parp蛋白(113 kd)水解为89 kd的特异性水解产物。 结论 杨梅素通 过激活caspase家族蛋白实现对肝癌细胞h

3、epg2细胞株的增 殖抑制及诱导凋亡作用。关键词杨梅素；肝肿瘤细胞；hepg2；凋亡中图分类号r735. 7 文献标识码a 文章编 号1673-7210 (2012) 12 (c) -0007-03key words myricetin； liver cancer cell；cell line hepg2； apoptosis 杨梅素(myricetin, myr) 是从天然植物藤茶(葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植 物)、杨梅等树皮中提取得到的多释基黄酮类单体化合物， 主要存在于杨梅的树皮中，其中嫩叶茎叶中含量较高，具有 显著的生物活性，如抗肿瘤、降低神经毒性、影响淋巴细胞 活化和增殖、拮抗

4、血小板活化因子(raf)、抗氧化抗衰老、 保肝退黄以及降血糖等作用1。其中，杨梅素在抗肝肿瘤 方面的作用日渐备受关注2-6 o近年来，国内不少学者对 其抗肝癌作用机制方面做了大量的总结和研究5-6,主要 是介绍杨梅素能有效诱导肿瘤细胞的凋亡，然而，由于研究 并不深入，未能从分子生物水平上阐释杨梅素的抗肿瘤机 制。本文通过甲基嗟哇蓝(mtt)法对细胞增殖活力进行检 测、倒置相差光学显微镜下观察荧光染色细胞生长形态、 annexin v-pi流式检测hepg2的细胞生长周期以及进一步 的dna片段电泳等实验，表明杨梅素通过影响肿瘤细胞hepg2 的生长周期诱导细胞凋亡从而发挥其抗肝癌作用，并深入揭

5、 示起作用机制与激活caspase家族蛋白直接相关。1材料与方法1.1材料1. 1. 1仪器olimpus ckx41临床型倒置显微镜，德 国macsquanttm流式细胞仪，上海新苗医疗器械制造有限公 司wj-iii型co2细胞培养箱。1. 1.2试剂及耗材 人类肝癌细胞hepg2 （购于广州市 中山医科大学病理科），小牛血清（购于广州蕊特生物科技 有限公司），杨梅素（由广州市中山大学药学院制备并提供, hplc纯度高于95%）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（包括 caspase-3和caspase-9）以及dna引物试剂（均购于美国 cst生物工程有限公司），rpmi1640和dmem培养基（购

6、于上 海阳光生物技术有限公司），96孔培养板（购于广州市华粤 行有限公司）。澳化乙锭、磷酸盐缓冲液（pbs, ph7.2）、二 甲亚矶（dmso）、琼脂糖、mtt等其他试剂，均为分析纯，购 于广州化学试剂厂。1.2方法1.2. 1杨梅素溶液的制备取杨梅素纯品适量，精密 称定，用0.1%dms0溶液溶解并稀释至杨梅素浓度为100 umol/l；临用时dmem培养液稀释。1.2.2 mtt法检测细胞死亡率和细胞增殖活力 以7 000/孔的密度接种于96孔板，每孔180 pl,培养过夜， 静置，分别加入10 ul由060 umol/l不同浓度的杨 梅素单体化合物溶液，并设置阴性对照组。药物作用48

7、h 后培养结束前4 h加入mtt,继续培养4 h后倾去培养液, 加入dmso 100 nl使溶解、显色，用酶联仪以570/630 双波长测定，以杨梅素浓度（umol/l）为横坐标，细胞死 亡率（%）为纵坐标，绘制杨梅素对hepg2细胞增殖影响的 曲线图，并利用bliss法算出细胞抑制生长率达50%时的杨 梅素的药物浓度，以ic50值表示。1.2.3荧光染色细胞形态观察从mtt法检测细胞死 亡率的结果中，选定一定浓度的杨梅素单体化合物溶液。以 100 000个/孔的细胞密度接种于6孔板（具有玻片）中， 培养24 h后，加入选定浓度的杨梅素溶液，作用不同时间 （分别为即刻和24 h）,用带电子拍摄

8、功能的倒置荧光显微 镜观察活细胞生长情况并记录。1.2.4 流式细胞术（fcm）分析 迅速收集由30、50 pmol/l不同浓度杨梅素作用下的hepg2细胞，每个浓度约 收集10 000个。用70% （v/v）的冷乙醇适量置49下固定 24 h, pbs 洗 2 次，1 g/l rna 酶 a37°c消化 30 min, 100 mg/l澳化乙锭染色20 min,用流式细胞仪测定分析 不同浓度的杨梅素单体化合物作用下的各期细胞比率及凋 亡率。利用流式细胞仪专用分析工具软件进行数据处理数 据以均数土标准差（x±s）表示，并进行统计学分析。1. 2. 5 western印迹法观

9、察蛋白质片段 不同浓度的 杨梅素处理后，收集悬浮和贴壁的hepg2细胞，以转速1000r/min离心10 min, pbs清晰3次，用细胞裂解液与2°c冰 浴裂解超过1 h,再以15 000 r/min离心5 min,收集 上清液。通过bio-rad法蛋白质定量处理后，以sds-page 凝胶电泳，后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，二抗封闭后以 氨基联苯胺显色，扫描并记录。2结果2. 1 mtt法细胞死亡率和细胞增殖活力检测结果杨梅素单体化合物对hepg2细胞有明显的生长抑制作 用，通过bliss法测得杨梅素作用48 h后其ic50值为(32. 18±2. 31) umol/l

10、o由结果可知，细胞死亡率随杨梅 素单体化合物的浓度的增加而增加。见图lo2. 2荧光染色后细胞形态变化结果60 umol/l的杨梅素溶液作用前，细胞核表面光滑且 具有均匀的荧光；而作用24 h后，细胞数目变少且形态变 圆，细胞核皱缩和坏死细胞碎片清晰可见，荧光浓染致密， 核膜边缘呈现新月状小体，具有典型的细胞凋亡特征，见图 2 3o2.3杨梅素对hepg2细胞株细胞比率及凋亡率的影响使用流式细胞仪利用pi染色法观察杨梅素对hepg2细 胞株的细胞周期影响，结果表明，不同浓度杨梅素溶液显著 影响hepg2肝癌细胞的细胞周期，其作用于hepg2细胞24 h后，与阴性对照组比较，g2/m期细胞比率明

11、显增高，g0/g1 期和s期细胞比率降低，差异均有统计学意义(均p <0. 05),呈明显的量效依赖关系，其中30 umol/l杨梅素 组g2/m期细胞比率低于50 umol/l杨梅素组，g0/g1、s 期细胞高于50 umol/l杨梅素组，差异均有统计学意义(p <0. 05)o 见表 lo2.4细胞周期相关蛋白cyclin bl、p34cdc-2蛋白表 达量变化结果三种不同浓度的杨梅素溶液作用于hepg2细胞24 h 后，p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而cyclinbl蛋白的 表达量明显上升，且呈现浓度依赖关系。见图4。2.5不同浓度的杨梅素溶液对凋亡机制相关蛋白par

12、p 和bcl-2表达量的影响不同浓度(0、30、50 jimol/l)的杨梅素溶液作用于 肝癌细胞hepg2细胞24 h后，bcl-2蛋白的表达量锐减， 并诱导半胱氨酸蛋白酶caspase-3的底物parp蛋白(113 kd)水解为89 kd的特异性水解产物。见图5。3讨论笔者通过多方面的试验数据证实，天然黄酮类化合物杨 梅素对肝癌细胞hepg2细胞有生长抑制作用，并呈现良好浓 度依赖关系。其中，流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果表明, 杨梅素对hepg2肝癌细胞的阻滞在g2/m期。另外，由western 印迹法检测推断，杨梅素通过增加cyclin bl蛋白的表达 量从而使hepg2肝癌细胞无法于

13、分裂后期脱离，进而将其抑 制于细胞g2/m期，结果与annexin v-pi流式凋亡检测结 果吻合。而在影响细胞周期的过程中p34cdc-2蛋白的表达 量未见显著增加或减少，正是这一结论的佐证。caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，能特异性裂解天 冬氨酸残基，在细胞凋亡信号传到中起着至关重要的作用。 根据它在级联反应中的作用可分为线粒体途径和死亡受体 途径。前者受线粒体内膜释放的细胞色素c的调控，而细胞 色素c受凋亡相关蛋白bid.bax和抗凋亡蛋白bcl-2,bcl-xl 等的调节，凋亡信号最终导致caspase-9前体活化成 caspase-9,进一步激活下游的caspase-3,最后降

14、解底物如 parp,导致细胞凋亡。后者最终引起caspase-8的活化，再 直接作用于caspase-3,使caspase-3激活，从而诱导细胞 凋亡7-13。而图5显示底物parp降解和抗凋亡蛋白bcl-2 锐减的现象，因此笔者推断杨梅素的诱导hepg2肝癌细胞凋 亡可能的作用机制为：参与线粒体途径的调控，通过活化 bel-2家族蛋白中的促凋亡蛋白（如bak. bax等）使线粒体 外膜通透性增加，进而激活caspase-3,使其底物parp水解, dna产生片段化最后完成hepg2细胞凋亡过程。为使其得到 进一步的证实，笔者认为接下来的研究可通过引入 caspase-3和caspase-9抑

15、制剂，尝试干预杨梅素影响线粒 体途径的调控，并检测其量效关系。参考文献1 张秀娟，黄清玲，季宇彬杨梅素的药理活性研究 进展j天津药学,2008, 20 (5)： 57-59.2 韦伟，姜庆杨梅素诱导膀胱癌细胞株biu-87凋 亡机制研究j.重庆医科大学学报，2010, 35 ( 120)： 1791-1794.3 张晓宏，邹祖全，徐琛炜，等.杨梅素对人肺腺癌 细胞增殖的影响及其机制j.营养学报，2010, 32 (2)： 162-164.4 ong kc, khoo he. biological effects of myricetin j. gen pharmacol, 1997,29(2)

16、： 121-126.5 俞瑜，曾耀英，刘良，等.杨梅素对淋巴细胞活化 及增殖的影响j中国药理学通报,2006, 22 (1)： 63-66.6 郑玲，荆瀛黎.杨梅素诱导人肝癌hepg2凋亡机制 研究j中国现代药物应用，2009, 3 (10)： 1-3.7 王秀英，冷水龙.小白菊内酯增强肝癌hepg2细胞 对顺钳敏感性的实验研究j.实用医学杂志，2011, 27 (2)： 177-180.8 杜宏，张娜，高霞，等.莲房原花青素对人肝癌细 胞hepg2生长及凋亡的作用j.实用医学杂志,2008,24(6)： 891-893.9 李璐，毕富勇，吕俊.银耳多糖诱导肝癌hepg-2 细胞凋亡的研究j实用医学杂志,2009, 25(7)： 1033-1035.10 隋春阳，李嘉，胡勇，等.tlr4受体在