细胞凋亡学习教案

1、会计学1第一页，共73页。 概述概述(i sh)第1页/共72页第二页，共73页。坏死(hui s)凋亡第2页/共72页第三页，共73页。apoptosis第3页/共72页第四页，共73页。第4页/共72页第五页，共73页。细胞细胞(xbo)坏死与细胞坏死与细胞(xbo)凋亡的区别凋亡的区别第5页/共72页第六页，共73页。 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别(qbi)特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激受累范围受累范围 单个细胞丢失单个细胞丢失 成群细胞死亡成群细胞死亡膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早

2、期即丧失早期即丧失细胞体积细胞体积 减小、固缩减小、固缩 增大肿胀增大肿胀染色质染色质 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成网状稀疏成网状细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿张破坏肿张破坏溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片基因组基因组DNA 有控降解有控降解 随机降解随机降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因调控基因调控 有有 无无后果后果 不引起炎症反应不引起炎症反应 引起炎症反应引起炎症反应意义意义 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式第6页/共72页第七页，共73页。第7页/共

3、72页第八页，共73页。 二二 、凋亡时细胞、凋亡时细胞(xbo)(xbo)的主要变化的主要变化第8页/共72页第九页，共73页。细细 胞胞 凋凋 亡亡第9页/共72页第十页，共73页。(扫描电镜)正常(zhngchng)细胞(扫描电镜) (透射电镜) 凋亡(dio wn)细胞凋亡(dio wn)小体第10页/共72页第十一页，共73页。DNA片断(pindun)化caspase激活(j hu)灭活凋亡(dio wn)抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca 2+ /Mg 2+ Zn 2+ 核酸内切酶激活核酸内切酶激活2. 生化改变生化改变（The biochemical characteristi

4、cs of apoptosis）第11页/共72页第十二页，共73页。第12页/共72页第十三页，共73页。第13页/共72页第十四页，共73页。凋亡凋亡(dio wn)诱导因素诱导因素 死亡死亡(swng)信号信号凋亡相关基因激活凋亡相关基因激活 凋亡的执行凋亡的执行 凋亡细胞清除凋亡细胞清除 第14页/共72页第十五页，共73页。凋亡凋亡(dio wn)的机制的机制第15页/共72页第十六页，共73页。细胞细胞(xbo)凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径第16页/共72页第十七页，共73页。第17页/共72页第十八页，共73页。第18页/共72

5、页第十九页，共73页。一系列caspase激活细胞凋亡第19页/共72页第二十页，共73页。FSALFas第20页/共72页第二十一页，共73页。第21页/共72页第二十二页，共73页。第22页/共72页第二十三页，共73页。第23页/共72页第二十四页，共73页。+caspase-independent apoptosisBid第24页/共72页第二十五页，共73页。第25页/共72页第二十六页，共73页。第26页/共72页第二十七页，共73页。大小亚基结合（二聚体） caspase活（四聚体） Pro-caspase： NH2末端结构域 、20KD亚基、 10KD亚基 剪切第27页/共72

6、页第二十八页，共73页。第28页/共72页第二十九页，共73页。第29页/共72页第三十页，共73页。第30页/共72页第三十一页，共73页。第31页/共72页第三十二页，共73页。第32页/共72页第三十三页，共73页。细胞细胞(xbo)凋亡凋亡第33页/共72页第三十四页，共73页。第34页/共72页第三十五页，共73页。第35页/共72页第三十六页，共73页。多样性：不同种类细胞有不同的信号多样性：不同种类细胞有不同的信号(xnho)(xnho)转转导系统导系统偶联性：死亡信号偶联性：死亡信号(xnho)(xnho)转导系统与细胞增殖转导系统与细胞增殖、分化过程、分化过程 中的信号中的信

7、号(xnho)(xnho)转导系统在一些环节上交叉转导系统在一些环节上交叉、偶联、偶联同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号(xnho)(xnho)转导系转导系 统引起细胞凋亡统引起细胞凋亡多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号(xnho)(xnho)途径触途径触 发细胞凋亡发细胞凋亡第36页/共72页第三十七页，共73页。第37页/共72页第三十八页，共73页。第38页/共72页第三十九页，共73页。第39页/共72页第四十页，共73页。第40页/共72页第四十一页，共73页。GF第41页/共72页第四十二页，共73

8、页。 - 诱导死亡受体诱导死亡受体Fas表达表达第42页/共72页第四十三页，共73页。C-mycC-myc双向调控双向调控(dio kn(dio kn) )凋亡凋亡 调控调控(dio kn(dio kn) )细胞周期基因，编码的蛋白细胞周期基因，编码的蛋白是是DNADNA结合蛋白，调控结合蛋白，调控(dio kn(dio kn) )基因转录。基因转录。 GF GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因充足时主要激活介导细胞增殖的基因 GF GF不足时激活凋亡基因不足时激活凋亡基因 第43页/共72页第四十四页，共73页。第44页/共72页第四十五页，共73页。第45页/共72页第四十六页，共73页

9、。第46页/共72页第四十七页，共73页。第47页/共72页第四十八页，共73页。第48页/共72页第四十九页，共73页。第49页/共72页第五十页，共73页。细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理合理(hl)(hl)利用凋亡相关因素利用凋亡相关因素1.1.诱导靶细胞凋亡诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗放疗、化疗 高热、高温高热、高温2.2.减少细胞凋亡减少细胞凋亡 ： NGF NGF、促生长因子、抗氧化剂、促生长因子、抗氧化剂抑制抑制Bcl-2Bcl-2抗凋亡抗凋亡(dio wn(dio wn) )作用作用促进促凋亡促进促凋亡(dio wn(dio wn) )基因作用基因作用增

10、强增强P53P53促凋亡促凋亡(dio wn(dio wn) )作用作用第50页/共72页第五十一页，共73页。 干预凋亡干预凋亡(dio wn(dio wn) )信号转导信号转导 调节凋亡调节凋亡(dio wn(dio wn) )相关基因相关基因 控制凋亡控制凋亡(dio wn(dio wn) )相关酶学机制相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降第51页/共72页第五十二页，共73页。 细胞凋亡细胞凋亡(dio wn(dio wn) )的检的检测测 1、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测 2、磷脂、磷脂(ln zh)酰丝氨酸外翻分析（酰

11、丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法） 3、线粒体膜势能（、线粒体膜势能（mt）的检测）的检测 4、DNA片断化检测片断化检测 5、TUNEL法法 6、Caspase-3活性的检测活性的检测 7、凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析的表达和细胞定位分析 第52页/共72页第五十三页，共73页。1、细胞、细胞(xbo)凋亡的形态学检测凋亡的形态学检测光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。现发泡现象，晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色

12、、瑞氏染色、苏木精染色等染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判一般以细胞核染色质的形态学改变来评判(pngpn)细细胞凋亡的进展情况。常用的胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。 电子显微镜观察电子显微镜观察第53页/共72页第五十四页，共73页。Nuclear morphol

13、ogical changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）第54页/共72页第五十五页，共73页。电镜观察电镜观察(gunch) 凋亡细胞体积变小，胞质浓缩。凋亡凋亡细胞体积变小，胞质浓缩。凋亡期期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多空泡的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多空泡结构。结构。IIa染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 第55页/共72页第五十六页，共73页。 流式细胞术检测流式细胞术检测(jin c)：第56页/共72页第五十

14、七页，共73页。2 2、磷脂、磷脂(ln zh)(ln zh)酰丝氨酸外翻分析（酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法）Phosphatidylserine(PS) Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞正常位于细胞(xbo)(xbo)膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞(xbo)(xbo)膜的内侧翻转到膜表面膜的内侧翻转到膜表面Annexin-VAnnexin-V： Ca2+ Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与依赖性磷脂结合蛋白，能与PSPS高亲和力特异性结高亲和力特异性结合。将合。将Annexin-VAnnexin-V进行荧光素（进行

15、荧光素（FITCFITC、R-PER-PE）标记后作为）标记后作为探针，利用流式细胞探针，利用流式细胞(xbo)(xbo)仪、荧光显微镜以及共聚仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞焦激光扫描显微镜检测细胞(xbo)(xbo)凋亡的发生。凋亡的发生。第57页/共72页第五十八页，共73页。2、磷脂、磷脂(ln zh)酰丝氨酸外翻分析（酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法）第58页/共72页第五十九页，共73页。第59页/共72页第六十页，共73页。第60页/共72页第六十一页，共73页。第61页/共72页第六十二页，共73页。Apoptotic HeLa cells were s

16、tained with FITC-AnnexinV + PI第62页/共72页第六十三页，共73页。3、线粒体膜势能、线粒体膜势能(shnng)（mt）的）的检测检测 线粒体荧光染料：线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱(jinru)说明线粒体内膜电负性的增高或降低。说明线粒体内膜电负性的增高或降低。第63页/共72页第六十四页，共73页。4 4、DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)化分析化分析 细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接

17、处断裂, 形成(xngchng)180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。第64页/共72页第六十五页，共73页。5、TUNEL法法第65页/共72页第六十六页，共73页。第66页/共72页第六十七页，共73页。第67页/共72页第六十八页，共73页。6 6、CaspaseCaspase活性检测活性检测(jin c)(jin c)第68页/共72页第六十九页，共73页。第69页/共72页第七十页，共73页。7 7、凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白TFAR19TFAR19蛋白的表达蛋白的表达 和细胞定位分析和细胞定位分析 凋亡早期凋亡早期TFAR19TFAR19表达表达并出现并出现快速核转位快速核转位(zhun wi)(zhun wi)现象，伴随着现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。凋亡小体中仍然可见。 利用荧光素（利用荧光素（FITCFITC）标记的）标记的TFAR19TFAR19单单克隆抗体为探针进行克隆抗体为探针进行TFAR19TFAR19蛋白的细胞定蛋白的细胞定位分析位分析 第70页/共72页第七十一页，共73页。Double staining analysis of nuclear localization ofT