植物细胞培养.PPT

1、第四章 植物细胞培养第一节第一节 悬浮培养悬浮培养第二节第二节 单细胞培养单细胞培养第三节第三节 培养细胞的次生代谢及产培养细胞的次生代谢及产 物积累物积累第四节第四节 植物细胞的规模培养植物细胞的规模培养1第四章 植物细胞培养植物细胞培养（植物细胞培养（plant cell cultureplant cell culture）：）： 指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞( (或小细胞或小细胞团团) )进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。优点优点：操作简便、重复性好、群体大等。：操作简便、重复性好、群体

2、大等。分类分类：1.1.根据规模：小规模培养、大批量培养根据规模：小规模培养、大批量培养2.2.根据培养方式：悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法根据培养方式：悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法3.3.根据要求的产物：诱变的细胞培养、根据要求的产物：诱变的细胞培养、生产次生产物的细胞培养生产次生产物的细胞培养引引 言言2第四章 植物细胞培养植物细胞培养需要解决的问题（1 1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；于生长；（2 2）营养物的供应；）营养物的供应；（3 3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化，培养）细胞密度过高引起细胞团聚甚至

3、分化，培养过程中细胞的分化的防止，过程中细胞的分化的防止，（4 4）细胞取得中微生物的去除；）细胞取得中微生物的去除；3植物细胞培养的意义：植物细胞培养的意义：（1）研究细胞生理代谢过程及各种）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；影响因子；（2）用于植物品种的改良；）用于植物品种的改良；（3）用于植物次生代谢物质的生产。）用于植物次生代谢物质的生产。4细胞培养过程：细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体；择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织；诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基；选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养；悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择；悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬

4、浮细胞的同步化；悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。悬浮愈伤组织形成及植株再生。 5第四章 植物细胞培养第一节第一节 悬浮培养悬浮培养 含义：将单个游离单细胞或小细胞含义：将单个游离单细胞或小细胞团按一定密度悬浮在液体培养基中团按一定密度悬浮在液体培养基中进行悬浮培养增殖的技术。由愈伤进行悬浮培养增殖的技术。由愈伤组织液体培养技术发展而来。组织液体培养技术发展而来。6第四章 植物细胞培养悬浮培养悬浮培养特点：特点：1 1、培养细胞可不断增殖，且生长速度快，适于大规、培养细胞可不断增殖，且生长速度快，适于大规模培养及工业化生产有用的细胞次生代谢产物。模培养及工业化生产有用的细胞

5、次生代谢产物。2 2、在液体培养基中，细胞和营养物质充分接触，细、在液体培养基中，细胞和营养物质充分接触，细胞状态相对保持一致。胞状态相对保持一致。3 3、大规模悬浮培养成本较高，因为它需要配置大型、大规模悬浮培养成本较高，因为它需要配置大型摇床、转床、连续培养装置、生物反应器、倒置摇床、转床、连续培养装置、生物反应器、倒置显微镜等特殊设备。显微镜等特殊设备。7分批培养（分批培养（Batch cultureBatch culture）分批培养含义：分批培养含义： 分批培养是在一个封闭的系统分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养

6、，即取出少一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。量培养物转接于新鲜培养液中。8特点特点 培养基体积固定培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈不断发生变化，呈S S增长。增长。9继代的方法和最佳时期继代的方法和最佳时期继代方法继代方法： 用注射器或移管吸取一定量用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。培养瓶里，继续进行培养。10继代11细胞生长曲线细胞生长曲线 在整个培养过程中，细胞数目不断发在整个培养过程

7、中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈胞的生长呈S S型曲线型曲线最佳继代时期最佳继代时期12滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养时间培养细胞数目培养细胞数目123451234513细胞生长各个时期的特点：细胞生长各个时期的特点：缓慢期滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期细胞生长和发育最明显的时期生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少静止

8、期生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。14讨论讨论 （1 1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2 2）加入条件培养基可以缩短滞后期。）加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。（3 3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。胞一直保持对数生长期。（4 4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，）如果使处

9、在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。则会引起细胞的大量死亡和解体。15操作注意事项：操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团，使用吸要小，只能通过单细胞或小细胞团，使用吸管或注射器。管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。可建立良好的细团沉降，再吸上层悬浮液。可建立良好的细胞悬浮培养物。胞悬浮培养物。16连续培养连续培养(Continuous culture):(Continuous culture): 是用一定容积的非密闭系统

10、进行细胞培养是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。续进行，同时有等体积的培养物排除系统。17连续培养（Continuous culture）加入培养基排出培养基及其培养物 二者体积相等二者体积相等分：开放式连续培养 封闭式连续培养18开放式和封闭式区别封闭式：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加。开放式：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞

11、数目保持恒定。19连续培养意义：连续培养意义：1、植物细胞代谢调节的研究。、植物细胞代谢调节的研究。2、次生物质的大量生产。、次生物质的大量生产。20第四章 植物细胞培养植物细胞培养的特性（1 1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁。素细胞壁。（2 2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；染，需用抗生素；（3 3）细胞生长的中期及对数期易凝聚为团）细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，不能象微生物一样均匀分散，悬浮培养较块，不能象微生物一样均匀分散，悬浮培养较难；难；21第四章 植物细胞培养（4 4）培

12、养时需供氧。）培养时需供氧。（5 5）细胞培养过程有结构与功能全能性）细胞培养过程有结构与功能全能性, ,因而因而易分化。易分化。（6 6）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（则不生长（25000-5000025000-50000个个/ML/ML）。）。22第四章 植物细胞培养悬浮培养步骤悬浮培养步骤一、愈伤组织诱导一、愈伤组织诱导二、悬浮系的建立与继代培养二、悬浮系的建立与继代培养三、悬浮细胞的生长动态三、悬浮细胞的生长动态四、悬浮培养细胞的同步化四、悬浮培养细胞的同步化23细胞的悬浮培养细胞的悬浮培养(cell suspension cultur

13、e) 是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。悬浮在液体培养基中进行培养的方法。241、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30-150rpm防细胞破裂2526第四章 植物细胞培养一、悬浮培养中起始物的建立一、悬浮培养中起始物的建立 选择适宜的外植体：选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。幼胚、下胚轴、子叶。 选择适宜的培养基：选择适宜的培养基：较高浓度；必要的附较高浓度；必要的附加物质。加物质。 愈伤组织的要求：愈伤组织的要求：松散性好，增

14、殖快，松散性好，增殖快，再生性强。再生性强。27第四章 植物细胞培养 悬浮培养物分散性良好，细悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性好，细胞团较小；均一性好，细胞形状和细胞团大小大致胞形状和细胞团大小大致相同；细胞生长迅速，悬相同；细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般浮细胞的生长量一般2-32-3天天增加增加1 1倍。倍。二、悬浮系的建立与继代二、悬浮系的建立与继代28第四章 植物细胞培养四、悬浮培养细胞的同步化四、悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。时通过细胞周期的某一特定时期。 方法：方

15、法： 分选法分选法 梯度离心、过滤梯度离心、过滤 饥饿法饥饿法 N N、P P同时饥饿处理一种海藻同时饥饿处理一种海藻50 h50 h，有二，有二分之一的细胞处于分之一的细胞处于G1G1期。加入期。加入DNADNA合成抑制剂，如合成抑制剂，如5-5-氨基尿嘧啶。细胞不能合成氨基尿嘧啶。细胞不能合成DNADNA，处于，处于G1G1和和S S期。期。 低温处理低温处理 - 4 DNA- 4 DNA合成受阻，细胞趋向合成受阻，细胞趋向G1G1期期29五、影响细胞悬浮培养的因素五、影响细胞悬浮培养的因素1 1、基本培养基的组成、基本培养基的组成（1 1）氮）氮 硝酸盐是最常用的氮源。硝酸盐是最常用的氮

16、源。（2 2）磷）磷 植物细胞能以各种方式吸收磷，其浓度是植物细胞能以各种方式吸收磷，其浓度是细胞分裂和生长的限制因子。细胞分裂和生长的限制因子。（3 3）硫）硫 硫的缺失使所有蛋白质合成自动停止。硫的缺失使所有蛋白质合成自动停止。2 2、有机成分、有机成分 氨基酸类、维生素类氨基酸类、维生素类3 3、碳源、碳源 碳水化合物，二氧化碳碳水化合物，二氧化碳4 4、植物激素、植物激素 生长素，细胞分裂素，乙烯生长素，细胞分裂素，乙烯5 5、PHPH及渗透压，培养基成分、振荡频率及渗透压，培养基成分、振荡频率30第四章 植物细胞培养第二节第二节 单细胞培养单细胞培养单倍体细胞培养主要包括三个方面：单

17、倍体细胞培养主要包括三个方面：一为花药培养；一为花药培养；二为小孢子培养；二为小孢子培养；三为末受精的子房和卵细胞培养。三为末受精的子房和卵细胞培养。31第四章 植物细胞培养第二节第二节 单细胞培养单细胞培养诱发植物产生单倍体主要有四种方法：诱发植物产生单倍体主要有四种方法：1 1、种间和属间杂交、种间和属间杂交2 2、物理照射和化学诱变、物理照射和化学诱变3 3、花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织、花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织再经适当途径产生单倍体植株。再经适当途径产生单倍体植株。32第四章 植物细胞培养第二节第二节 单细胞培养单细胞培养单细胞培

18、养方法：单细胞培养方法：对分离得到的单个细胞进行对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。到长成完整植株的技术。细胞平板培养细胞平板培养看护培养看护培养微室培养微室培养纸桥培养法纸桥培养法33植物单细胞培养方法：（一）平板培养法（一）平板培养法 分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。养皿内的培养过程称为平板培养法。 优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在优点：单细胞在

19、培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察。显微镜下对细胞进行定点观察。 由于它具有筛选效率高、操作简便等优点，由于它具有筛选效率高、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。害或影响组织吸收。3435第四章 植物细胞培养（二）看护培养（二）看护培养 Muir(1953)Muir(1953)首创此法首创此法获得烟草单细胞体系。获得烟草单细胞体系。 优点：简便易行，效果优点：简便易

20、行，效果好。好。 缺点：不能在显微镜下缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过追踪细胞分裂、生长过程。程。指利用生长的愈伤组织所产生的指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞或者异种愈伤物质来培养单细胞或者异种愈伤组织等的方法组织等的方法36第四章 植物细胞培养三、微室培养三、微室培养 在人工制造的无菌小室中，将一在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。方法。 优点：可对培养细胞连续进行显优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过

21、程。分裂、分化等过程。 缺点：培养基少，营养和水分难缺点：培养基少，营养和水分难以保持，以保持，PHPH变动幅度大，培养细变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。胞仅能短期分裂。37四、纸桥培养法四、纸桥培养法 将滤纸的两端浸入液体培养基中，使滤纸中间部分将滤纸的两端浸入液体培养基中，使滤纸中间部分露出培养基表面，将所要培养的细胞放在滤纸的表面上露出培养基表面，将所要培养的细胞放在滤纸的表面上培养。培养。单细胞液体培养基滤纸38单细胞的分离单细胞的分离q由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞q由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞391、由完整的植物器

22、官分离单细胞机械法机械法酶解法酶解法叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料40机械法机械法Ball&Joshi (1965)Ball&Joshi (1965)Noggle (1967)Noggle (1967)Joshi &Ball (1968)Joshi &Ball (1968)研究者和时间：研究者和时间：研究材料：花生成熟叶片研究材料：花生成熟叶片第一种方法：用刀片刮叶片第一种方法：用刀片刮叶片41具体方法具体方法: :撕去下表皮撕去下表皮露出叶肉细胞露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞42第二种方法：叶片研碎、离心第二种方法：叶片研碎

23、、离心研碎成粉研碎成粉加研磨介质加研磨介质过滤、离心过滤、离心43 只有薄壁组织排列松散，细胞间结只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。取得成功。44酶解法酶解法TakebeTakebe等（等（19681968）最早报道：用果胶酶处）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶加果胶酶过滤、离心过滤、离心45机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法机械法酶解法酶解法1. 细胞不受到酶的伤害；细胞不受到酶的伤害；2. 不用质壁分离；不用质壁分离；3. 细胞产量低；细胞产量低；4. 细胞易破。细

24、胞易破。1. 细胞受到酶的伤害；细胞受到酶的伤害；2. 要质壁分离；要质壁分离；3. 细胞产量高；细胞产量高；4. 细胞不易破。细胞不易破。462 2、由培养组织（愈伤组织）分离单细胞、由培养组织（愈伤组织）分离单细胞材料：胡萝卜肉质根材料：胡萝卜肉质根步骤：步骤：1 诱导产生愈伤组织2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；47由愈伤组织分离单细胞的方法：由愈伤组织分离单细胞的方法：1 1、将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培、将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培养基的三角瓶中进行振荡培养，获得悬浮细胞液。养基的三角瓶中进行振荡培养，获得悬浮细胞液。2 2、用孔径为、用

25、孔径为200um200um的无菌网过滤，的无菌网过滤，4000RPM/M4000RPM/M离离心，除去比单细胞小的碎片，获得纯净的细胞悬心，除去比单细胞小的碎片，获得纯净的细胞悬浮液。浮液。3 3、用、用60-100UM60-100UM的网过滤，再用的网过滤，再用20-30UM20-30UM的网过滤，的网过滤，离心除去细胞碎片。离心除去细胞碎片。4 4、回收获得的单细胞，并用液体培养基洗衣净，、回收获得的单细胞，并用液体培养基洗衣净，可用于培养。可用于培养。48单倍体的应用价值：单倍体的应用价值：1 1、在植物育种中使后代迅速纯合、提高选择效率、在植物育种中使后代迅速纯合、提高选择效率3 3、

26、排除杂种优势对后代的影响、排除杂种优势对后代的影响、4 4、遗传研究的良好实验材料体系，消除致死原因、遗传研究的良好实验材料体系，消除致死原因5 5、突变体的筛选，选育新型自交系、突变体的筛选，选育新型自交系6 6、遗传转化的受体材料，基因表达研究的良好材料、遗传转化的受体材料，基因表达研究的良好材料49第四章 植物细胞培养第三节第三节 培养细胞的次生代谢及产物积累培养细胞的次生代谢及产物积累一、概述一、概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官合物，其产生和分

27、布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。组织和生长发育期的特异性。50植物次生代谢产物种类植物次生代谢产物种类酚类化合物酚类化合物含氮有机化合物含氮有机化合物萜类化合物萜类化合物其其 它它醌类醌类黄酮类黄酮类简单酚类简单酚类高等萜类高等萜类低等萜类低等萜类多炔类多炔类有机酸有机酸胺类胺类生物碱生物碱生氰苷生氰苷莨菪碱莨菪碱酪醇酪醇花青素花青素紫草宁紫草宁青蒿素青蒿素人参皂甙人参皂甙AA类似物类似物苦杏仁苷苦杏仁苷51525354香豆素葡萄糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A甲戊二羟酸活性异戊二烯蒽醌甾类化合物萜类化合物甲瓦龙酸途径三羧酸循环有机酸脂肪族氨基酸生物碱多酮途径脂肪酸、环状化合物磷酸

28、戊酸途径4-磷酸赤藓糖糖酵解莽草酸莽草酸途径芳香族氨基酸黄酮生物碱55第四章 植物细胞培养2.2.植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。等领域具有重要意义。 李时珍（李时珍（15931593）在）在本草纲目本草纲目中所开列的中所开列的18921892种药物绝大多数是植物药物，其药物的有种药物绝大多数是植物药物，其药物的有效成分均为次生产物。效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料，可以用于杀虫、杀菌，而对名贵化妆品原料，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理

29、想的环保产品。环境和人畜无害，是理想的环保产品。56第四章 植物细胞培养3 3规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境保护生态环境 提高生产效率提高生产效率 发展新型生物技术产业发展新型生物技术产业来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产方式生产周期生产周期紫草宁含量（干重）紫草宁含量（干重）完整植株完整植株2-32-3年年1-21-2植物细胞培养植物细胞培养3 3 周周141457第四章 植物细胞培养次生代谢产物的工业化生产次生代谢产物的工业化生产 2020世纪世纪4040年代后期，年代

30、后期，J.BonnerJ.Bonner首次报道首次报道银胶菊植物组织可获得橡胶。银胶菊植物组织可获得橡胶。 2020世纪世纪8080年代以来，细胞大规模培养生年代以来，细胞大规模培养生产有用的物质，如药物、食品、调料、产有用的物质，如药物、食品、调料、香精、颜料等再生资源。香精、颜料等再生资源。58第四章 植物细胞培养植物次生代谢产品的市场潜能植物次生代谢产品的市场潜能产品成分产品成分用途用途年销售额（亿美元）年销售额（亿美元）长春花碱长春花碱治疗白血病治疗白血病18-2018-20（美国）（美国）阿吗灵阿吗灵循环系统障循环系统障碍药碍药5-255-25（全世界）（全世界）奎宁奎宁治疗疟疾治疗

31、疟疾5-105-10（美国）（美国）致热素致热素杀虫剂杀虫剂2020（全世界）（全世界）毛地黄毛地黄心脏病药心脏病药20-5520-55（全世界）（全世界）59601234567891011121314151617181920123Ph1Ph2Ph3ONC6H5OHC6H5OOOOOHHAcOHOHOHAcOC6H5OPaclitaxel (Taxol)61紫杉醇研发过程NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖Ramesh Panchagnula, International Journal of Pharmaceutics.1998(

32、172)1-15.62 0.83.46.61214.818.2202505101520253019921994199519981999200020012002300300350350480480620620780780100010000 0200200400400600600800800100010001200120020002000年年20022002年年20042004年年需求量需求量图图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）：国际紫杉醇销售额（亿美元）636465优点：生长周期缩短 简便、直接缺点：1、紫杉

33、醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂66缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相 对容易，充分利用再生资源 2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）67优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究68红景天是景天科红景天是景天科(Crassulaceae)(Cra

34、ssulaceae)红景天属红景天属( (RhodiolaRhodiola L.) L.)植植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉质匍匐根状茎。我国对物，为多年生草本或亚灌木，常具肉质匍匐根状茎。我国对红景天的应用已有很久的历史，在红景天的应用已有很久的历史，在千金翼方千金翼方、本草纲本草纲目目、四部医典四部医典中早有记载。中早有记载。高山红景天高山红景天( (Rhodiola sachalinensisRhodiola sachalinensis A.Bor) A.Bor)又名库页红景又名库页红景天，为景天科红景天属（天，为景天科红景天属（RhodiolaRhodiola L. L.）多年生草本

35、植物，）多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有增强记忆、改善心脑血管是长白山珍稀药用植物之一，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能、增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、降血糖、系统功能、增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗微波辐射。抗病毒、抗微波辐射。 以红景天为例以红景天为例69UTP+葡糖糖-1-磷酸UDP-葡糖糖+pi尿苷转移酶UDP-葡糖糖+酪醇红景天甙+UDPUDP-葡萄糖基转移酶红景天甙生物合成最后一步反应机制已经清楚，红景天甙生物合成最后一步反应机制已经清楚，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDP-UDP-glucosy

36、ltransferaseglucosyltransferase，UDPGTUDPGT，UGTsUGTs）以尿苷二）以尿苷二磷酸葡萄糖（磷酸葡萄糖（UDPGUDPG）和酪醇为底物催化合成红景）和酪醇为底物催化合成红景天甙天甙 表达量70尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因基因生物信息学分析生物信息学分析 基因及表达基因及表达特性分析特性分析基因分离基因分离功能分析功能分析构建植物构建植物高效表达高效表达载体载体转化回高转化回高山红景天山红景天71 高山红景天高山红景天UDP-葡萄糖基转移酶葡萄糖基转移酶基因基因（UGT1）的分离及特性分析的分离及特性分析72高山红景天高山红景天U

37、DP-葡萄糖基转移酶基因葡萄糖基转移酶基因 95Scutellaria(黄 芩 ) 0tomato1 0Nicotiana tabacum 26potato1AATAAATTCATCATTAGACTTTTGTTGATTTTGTCTCCACCATTATCATTCCCTTTCAAGAATTCCAAATCTGCAGAATAATATTAAGATTCCAT.CTGTTCTTGGGTAGTAAAAATGGTAGTTAAAAAATTAA 190Scutellaria(黄 芩 ) 70tomato1 81Nicotiana tabacum 121potato1TATAGAATCTTGAAATGGGACAACT

38、CCACATAGTCCTTGTTCCAATGATAGCTCATGGCCACATGATCCCCATGCTTGACATGGCCAAGCTCTTC.TCATTTTTTCTTCTTTCCCGATGATGCTCAAGGTCATATGATACCTACACTTGACATGGCGAACGTTGTC.ATGGGTCAGCTCCATTTTTTCTTCTTTCCTGTGATGGCTCATGGCCACATGATTCCTACACTAGACATGGCGAAGCTCTTTCAACCTGCAACAGTGGCGAAATCCTCCATGTTCTTTTCCTTCCCTTCTTATCCGCTGGTCATTTCATCCCATTAGTT

39、AACGCCGCAAGGCTATTCAAAATTGGGGGGGAACCAACCCTTTCCCCCCCAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCGGTTTGGAATTTAAGGGCCCCTTTCCCAAATTTGGGGGGGGCCCCCCAAAACCAAATTTTGGGAAAATTTTCCCCCCCCCCTTAAACCAAACCCTTTTTTTGGGAAAACCCCAAATTTGGGGGGGCCCCGGAAAAAAAGGGCCCTTTTCCTTTTTTTCCC 270Scutellaria(黄 芩 ) 162tomato1 17

40、3Nicotiana tabacum 216potato1TCATCCAGAGGAGTCAAAACCACCATCATCGCCACTCC.TGCCTTCGCTGAGCCCATCAGAAAGGCCCGAGA.ATCGGGCCAGCTTGTCGTGGTGTTAAAGCCACTATAATCACAACACCTCTCAATGAATCTGTTTTCTCTAAAGCTATTGAGAGAAACAAGCA.TTTAGGTATGCTTCACGTGGTGTTAAGGCCACTATAATCACAACCCCACTCAATGAATTCGTTTTCTCCAAAGCTATTCAAAGAAACAAGCA.TTTGGGTATGCC

41、TCCCGCGGTGTTAAAGCCACAATCCTCACTACCCCTCATAATGCCTTACTTTTTAGATCTACTATTGACGATGATGTTCGAATTTCCGGATTGGGCCCCTTTTTTCCCCCCCCGGGGTTGGGGGGGGTTTGGGGTTTTTTTAAAAAAAAAAAGGGCCCCCCCCAAAACCCCTTAAAATTTTAAAAATTTTCCCCAAACCCCAAAAAACCCCCCCCCCCCCCTTCCCTTCCAAAAAATTTGGGAAAATTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCCCTTAAAAAAAGGCCCCTTTAAAA

42、TTTTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAACCCAAAAGGCCCAAATTTTTTTCCGGGGGGGGGGTTAATTT 362Scutellaria(黄 芩 ) 257tomato1 268Nicotiana tabacum 311potato1CGACATCGGCCTCACCACCACTAAGTTCCCTCCAAAAGGGTCCTCATTGCCGGACAACATCCGGAGCTTGGATCAAGTGAC.AGATGATTTGCTGAAATTGATATTCGTTTACTAAAATTCCCAGCTAAGGAGAATGATTTGCCTGAAGATTGTGAGCGTCTTGATCTT

43、GTACCTTCTGATGACAAACCGAAATCGAAATCCGTTTGATCAAATTCCCAGCTGTTGAAAACGGCTTACCTGAAGAATGCGAACGCCTCGATCAAATCCCTTCAGATGAGAAGCTCCCATTTCTATCGTAACTATTAAATTCCCCTCTGCTGAAGTTGGGTTGCCTGAAGGAATTGAGAGCTTTAACTCTGCCACTTCACCTGAAATGCCCGGGAAAAAAAAATTTTCCGGGAATTAAATTTTCCCCCGGTTAACCAAATTTTTAAAAAAAAAAATTTTTTTTCCCCCCCCCCCCAAGGC

44、CCCTTTAAAATTGGGGAAAAAAAAACCGGGGGTTTTTTTTGGGCCCCCCCCTTTGGGGAAAAAAAGGGAAAAAAAGGCCGGGAAAGGGAAGGGGCCCCCTTTTTTGGGAAAATTTCCCAAAAGGGTTTCCAACCCCTTTTTTCCCAAAGGGAAATTTTGGGGAAAAAAAAAGGGCCCC 457Scutellaria(黄 芩 ) 352tomato1 363Nicotiana tabacum 406potato1TCCCACACTTTTTTCGGGCCCTGGAATTGCTCCAAGAACCTGTTGAGGAGATCATGGA

45、AGATCTGAAGCCTGATTGTCTTGTTTCAGACATGTTCTCCCAAACTTCTTAAAAGCTGCGGCTATGATGAAAGATGAATTTGAGGAGCTTATTGGAGAATGTCGCCCTGATTGTCTTGTTTCTGATATGTTCTCCCAAACTTTTTCAAAGCTGTAGCTATGATGCAAGAACCACTAGAACAGCTTATTGAAGAATGTCGCCCCGATTGTCTTATTTCAGATATGTTCCTCATAAAATTTTTTATGCTCTTTCTCTTCTACAAAAGCCAATGGAAGATAAAATTCGTGAACTCCGTCCTGA

46、TTGCATTTTTTCTGATATGTACTTTCCCCCCCCCCAAAAAAAAAACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAGGGGCCCCTTTCCTTTGGGGGCCCTTTAATTTTGGGAATTTTGGCCCAAAAAAAAGGGAAAAAACCCCCCAAATTTTTTGGGGAAAAAAGGGAAAAGGGAATTTTTAAAATTTTTTTGGGAAAAAGGGGAAAAAAACCGGTTCCCGGGCCCCCCCCCCTTTGGGGAAAATTTTTTTTGGGGTTTCCCTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTTCCCCAAGGGGAAAATT

47、TAAAATTTTGGGGTTTTTTTCCCC 552Scutellaria(黄 芩 ) 447tomato1 458Nicotiana tabacum 501potato1TTGCCATGGACGACCGACTCGGCAGCCAAGTTTGGTATTCCGAGGTTGCTCTTCCATGGCACCAGCTTGTTTGCTCGCTGTTTTGCTGAGCAGATCTTCCATGGACTACTGATAGTGCAGCCAAATTTAGCATACCAAGAATTGTATTCCATGGAACTAGTTACTTTGCCCTTTGTGTTGGCGATACGATCTTCCTTGGACTACTGATACTG

48、CAGCAAAATTTAACATTCCAAGAATAGTCTTTCATGGCACAAGCTTCTTTGCTCTTTGTGTTGAGAATAGCGTTTCCCTTGGACAGTAGATATTGCTGATGAGCTTCACATCCCTCGTATTTTGTACAATTTGTCTGCTTACATGTGCTACAGCATTATGCACAACCTCCTTTTTTCCCCCCCCAATTTTGGGGGGGGAAAACCCCTTAAACCCTTGGGGAAAATTTAAACCTTTGGGGCCCCAAAGGGGCCCCCAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAACCCAAAATTTTTTCCCCCCCC

49、AAAAAGGGGAAAAATTTTTTGGTTTTCCTTTTTTTCCCCCCAAAATTTTGGGGGGCCAAACCCCTTAAAGGGCCTTTTAACCCTTTTTTTTTTGGGCCCCCCCCTTCCTTTGGGGTTTGGTTTTTTTTGGG GGGGAAAATTAAAAACCAATTTT 644Scutellaria(黄 芩 ) 539tomato1 550Nicotiana tabacum 596potato1GAGTATCCAGAAACCATATAAAAACGTGTCGTCAGAT.TCCGAGCCGTTTGTTCTTCGGGGTCTTCCACATGAAGTGAGCT

50、TTGTGAGGACACCAGGCGTAATAAGCCTTTCAAGAATGTGTCATCGGAT.ACTGAAACTTTTGTTGTACCGGATTTGCCACATGAAATTAGGCTAACTAGAACACCAGGCTAAATAAGCCTTTCAAGAATGTGTCCTCAGAT.TCTGAAACTTTTGTTGTACCGGATTTGCCTCACGAAATTAAGCTGACCAGAACCCTAAGGTTTACAGACCTCACAAGCAGCCTAATCTAGACGAATCTCAAAGTTTCGTGGTTCCTGGTTTACCTGATGAGATAAAGTTCAAGTTATCCCCCAAAAG

51、GGGGGCCTTTTTAAAAAATTAAAAAAAAACCCCCCCCTTTTTTAACCCAAAAAAAAGGGAAAAAAATTGGGTTTGGGTTTCCCTTTCCCAAAGGGGAAAATTTTTTCCCCTTTGGGAAAAAAAAAACCCTTTTTTTTTTTTTTGGGGTTTTTTTGGGTTTTAACCCCCCCGGGGGGGAATTTTTTTTTTTGGCCCCCCCCAACCCAAAATTTGGGGAAAAAAAAAATTTTTTAAAAAAGGGCCTTTTAAACCGGAAAGGGAAAAAACCCCAACCCC 733Scutellaria(黄 芩 ) 62

52、5tomato1 636Nicotiana tabacum 688potato1AAATCCCT.GATTATGAATTACAGGAAG.GTGGTGACGATGCCTTCTCAAAGATGGCGAAGCAAATGAGGGACGCTGATAAGAAAAGCTATAGTTGTCT.CCGTTTGAGCAATCGGATG.A.AGAGACG.GGTATGGCTCCCATGATTAAAGCTGTGAGGGAATCGGATGCGAAGAGCTATAGGTGTCT.CCGTTTGAGCGATCTGGGG.A.AGAGACG.GCTATGACCCGGATGATAAAAACAGTCAGGGAATCAGATT

53、CAAAGAGCTATAACTGACAGATGATCTGAGAAAGTCGGATGACCA.AAAGACT.GTTTTTGACGAATTGCTCGAACAAGTTGAAGATTCGGAGGAACGAAGCTATAAAAAATTTTGGGTTCCCCTTTCCCCGGTTTTTTTTTTGGGGAAAAGGGCCAAAAAATTCCGGGGGGAAAAGGGAAAAAAGGGAAAGGGGAAAACCCCGGGGGGGCCTTTAATTTTGGGGCCCCCCCAAGGAAATTTTGGGGAATTTAAAAAAAAAACCAAAAAGGGTTTTGGAAAGGGGGGGGGGAAAAAATTT

54、CCCCGGGGGGAAAATTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGCCCCTTTTAAAATTTT 826Scutellaria(黄 芩 ) 718tomato1 729Nicotiana tabacum 783potato1GGTGACGTGATCAATAGTTTCGAGGAGCTGGAATCGGAATATGCTGATTATAACAAGAATGTTTTTGGGAAGAAAGCTTGGCATATAGGCCC.TGGAGTTATATTCAATAGCTTTTATGAGCTTGAATCAGATTATGTTGAACATTACACTAAGGTTGTAGGTAGAAAAAATTGGGCTATT

55、GGTCC.GGGAGTTGTTTTCAACAGTTTCTATGAGCTTGAAACAGATTATGTTGAGCATTATACTAAGGTGCTGGGTAGAAGAGCTTGGGCTATTGGCCC.TGGCATTGTTCATGATACATTTTATGAGCTAGAACCTGCATATGTTGACTACTACCAGAAATTAAAGAAACCAAAATGTTGGCATTTTGGTCCGCTGGGGGGGGAAGGGTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTCCCAAAAAAATTTAAAAGGGTTTTTTTTTTCCTTTAAAATTTGGGGAAAAGGGGCCCCTTTTTTGGGGAAA

56、AAAAATTCCCCAAGGGGAAAAATTTTAAAATTTTGGGGTTTTTTTGGGGAAAACCAAAATTTTTTAAAACCCAAAAAGGAAAAAAAAGGGGGTTTTTTTTTGGGGGGGGTTAAAGGAAAAAAAAAAAAAAGGCCTTTTTTTTGGGGGGGGCCAATTTTAAATTTTTTTGGGGGGGGCCCCCCCCCCTTT 920Scutellaria(黄 芩 ) 809tomato1 820Nicotiana tabacum 866potato1CTAAAGCTATTCAACAACAGGGCTGAACAGAAATCATCACAAAGGGG

57、CAAGGAATCAGCCATAGACGATCACGAATGCT.TAGCATGGCTCAACTCTTTCGCTGTGCAATAGGGATATTGAAGATAAAGCG.GAAAGAGGGAGGAAATCATCTATCGATGAACACGCGTGCT.TGAAATGGCTTGATTCTATCGATGTGCAACAGGGACATTGAAGATAAAGCT.GAAAGAGGAAAGAAATCCTCTATTGATAAACACGAGTGCT.TGAAATGGCTTGATTCTCTCATTTTGCATCCAAAATCCGTAGTAAGGAACT.AATTTCTGAGCATAAC.AACAATGAGATT

58、GTTATAGATTGGTTGAATGCCCCTTTTAATTTCCCGGGCCTTTTGGTTTTGGGCCCCAAAAAAACCCAAAAAGGAAAAATTAACCTTTGGGAAAAAAAGGAAAATTAAAAAAAAAAGGCCCCTTGGAAAAAAAAAAGGGAAGGGGGGGAAAAAAAGGGAAAAAAAAAATTTCCCAATTCCCTTAAATTTGGGAAAATTGGAAAAAAACCCAAACCCGGGGAAAGGTTTTGGGGCCCTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTGGGGGGGGCCCTTTTTTAAAAAATTTTTT 1015Scutella

59、ria(黄 芩 ) 904tomato1 915Nicotiana tabacum 961potato1CAAAAAAGCCCAACTCAGTTGTTTACATGTGTTTTGGAAGCATGGCCACATTCACTCCAGCCCAATTGCACGAAACTGCAGTCGGGCTCGAATCCCGAAGAAATCAAGTTCCATTGTTTATGTTTGTTTTGGAAGTACAGCAGATTTCACTACAGCACAGATGCAAGAACTTGCTATGGGGCTAGAAGCCCGAAGAAACCAAGTTCCGTCGTTTACGTTTGTTTTGGAAGCGTAGCGAATTTCACTGC

60、ATCACAACTGCACGAACTTGCTATGGGAATTGAAGCTCACAGAAACCTAAATCGGTTCTCTATGTATCTTTCGGAAGCATGGCTAGATTTCCTGAGAGCCAACTGAATGAAATAGCCCAAGCTCTGGATGCTCCCCAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACCCCCCCAAAAAAAATTTTTTCCCCCCGGGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTAAAACCGGGTTTTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGAAAAAAAAGGGGCCCAAATTTAAGGGGCCCCAAAAAAATTTTTTTTCCCAAACCCCTTTT