流式细胞术（课堂PPT）

1、1流式细胞仪介绍流式细胞仪介绍 2To help all people live healthy livesTo help all people live healthy lives 流式细胞术历史回顾 1973年BD推出世界第一台流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） 1980年中国的第一台流式细胞仪FACS II 生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域 FACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国70%，FACSAria 市场占有率达到90。3流式细胞术流式细胞术 定义：在流动的状态中检测单个细胞或颗粒的多项

2、理化及功能性指标的一种分析技术 特点：特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 检测的样本种类多样：前提单细胞悬液 外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，腹水，实体组织（肿瘤、腺体、淋巴结），培养细胞 流式分选流式分选：以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离4流式检测原理流式检测原理 通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞的各种特征。5流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类 台式机型 临床型：FACSCalibur，FACSCanto，FACSCount 科研型: LSR，FACSAria，FACSArr

3、ay 非台式机型: FACSVantage SE， FACSDiVa6流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成液流系统：将待测样本按一定的速度一个个通过检测区光学系统：产生并收集散射光和荧光信号电子系统：光学信号处理和显示7液流系统样本流液流系统样本流细胞或微粒的悬浮液通过50300um的小孔引入鞘液，使得细胞或微粒单个单个流经检测区FALS Sensor90LS SensorLaser8样本细胞的大小 0.5 - 40微米9液流系统鞘液液流系统鞘液当液流系统符合雷诺兹公式时，样品流能保持在液流的中心区流动而不和鞘液混合，即形成层流雷诺兹公式（雷诺兹公式（Reynolds number）当当R

4、e 2300, 将会发生湍流将会发生湍流流体动力学的聚焦效应（Hydrodynamic Focusing）：大量的鞘液流包裹少量的样本流，并对样本流在中轴位置具有聚焦的作用Re dv whered tube diameter density of fluidv mean velocity of fluid viscosity of fluid10液流系统压力系统液流系统压力系统11液流系统压力系统液流系统压力系统1213光学系统光源光学系统光源光束需和细胞或微粒在检测区正交特定的荧光染料需要特定波长的激发光源两类激发光源：激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑，弧光灯：光束散交，能量低，位置和功率

5、闪烁，14光学系统散射光信号光学系统散射光信号前向角散射光（FSC):和细胞或待测颗粒的大小和表面积有关可以用来区分死/活细胞侧向角散射光（SSC):和细胞结构复杂性和颗粒性有关可以用来区分粒/非粒细胞15光学系统散射光信号光学系统散射光信号散射光可以用来区分不同细胞群体的最基本的形态差异-常常用散点图“Dot Plots”来显示- 图上的每一个点代表一个细胞的相应信息 16光学系统光学系统- -荧光信号荧光信号细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关荧光在 90角的方向上检测荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收

6、特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的1718荧光补偿的调节荧光补偿的调节FITCPE450500550600650FL1 = FITC + x% PEFL2 = PE + y% FITC19荧光补偿的调节荧光补偿的调节FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1 - %FL2(0 30%)(0 1%)20如何进行补偿？ 1、选择补偿管用的细胞，一定要含有补偿用的抗体阳性和阴性的细胞群，阳性群体的荧光并尽可能强。 2、染色同型对照，调节电压尽可能高，一定要能看到完整的阴性细胞群，大一点的没有太大关系。 3、选择细胞群中自发荧光相同的细胞群进行分析（例如外周血可选择淋巴细胞）。2

7、122光学系统光学滤片光学系统光学滤片长通滤光片 只容许某一波长之上的光通过 短通滤光片 容许某一波长之下的光通过 带通滤光片 容许某一波长的上下一个极小范围内的光通，带宽可以特定化 二向色性 当滤光片和光源成45度角的方向放置，原本被通过的光照样通过，而原本会被封锁的光将会沿着90度角的方向被反射出去23LONG (700nm)550 Long Pass 650 Short Pass SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengths Bloc

8、ked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass 650 Short Pass SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nm24单激光光学平台单激光光学平台光电二极管光电二极管检测区检测区高感度高感度 PMTs氩离子激氩离子激光器光器25光学系统荧光监测器光学系统荧光监测器两种常见的荧光监测器光电二级管:用于强信号的探测 (如, 前向散射光探测器)光电倍增管(PMT):比光电二极管更敏感但太强的光会

9、对其造成破坏有最适的波长检测范围26电子系统数据的采集和处理电子系统数据的采集和处理对探测器检测到的信号加以处理前置放大在从远处的探测器传到中央电子系统前对信号进行放大放大调节信号的强度线性的或对数的放大计算脉冲信号的积分，高度或宽度时间调整多参数检测时所必须的数模转换272829液流系统液流系统光学系统光学系统电子系统电子系统细胞周期及倍体分析细胞周期及倍体分析31 倍体分析原理倍体分析原理 细胞增殖周期：分为细胞增殖周期：分为G0G0、G1G1、S S、G2G2、M M期。期。 G0/G1G0/G1期细胞为二倍体细胞，其期细胞为二倍体细胞，其DNADNA含量用含量用2N2N表示，表示，G2

10、/MG2/M期为四倍体细胞，其期为四倍体细胞，其DNADNA含量用含量用4N4N表示，表示，S S期细期细胞胞DNADNA含量介于此两者之间。含量介于此两者之间。 利用荧光染料如利用荧光染料如PIPI（Propidium iodidePropidium iodide）与细胞内）与细胞内的的DNADNA结合，结合量多少可反映细胞内结合，结合量多少可反映细胞内DNADNA含量。含量。 FCMFCM分析一个群体细胞峰分析一个群体细胞峰DNADNA倍体与细胞周期时，将倍体与细胞周期时，将DNADNA含量直方图分为三部分，即含量直方图分为三部分，即G0/G1, S, G2/MG0/G1, S, G2/M

11、期期三个细胞峰。三个细胞峰。 G0/G1G0/G1和和G2/MG2/M细胞峰细胞峰DNADNA的含量成正态分布，的含量成正态分布，S S期细期细胞峰则是一个加宽的正态分布。胞峰则是一个加宽的正态分布。32细胞周期示意图及细胞周期示意图及DNADNA含量直方图含量直方图 细胞周期示意图及细胞周期示意图及DNADNA含量直方图含量直方图33荧光信号的面积 一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。 34宽度FL2-

12、W FL2-W常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高，影响测量准确性 3536几个概念几个概念 DNA指数指数(DI)：通过比较通过比较G0/G1G0/G1期细胞峰位期细胞峰位置的变化显示，为置的变化显示，为 测量样本测量样本G0/G1G0/G1期期DNADNA荧荧光通道数与正常人淋巴细胞光通道数与正常人淋巴细胞G0/G1G0/G1期期DNADNA荧光荧光通道数比值。通道数比值。 CVCV值：变异系数，由于仪器及实验样本的影值：变异系数，由于仪器及实验样本的影响

13、，测定过程中存在的漂移现象，其包括两响，测定过程中存在的漂移现象，其包括两部分，即反应仪器精密度的部分，即反应仪器精密度的CVCV值及实验样本值及实验样本的的CVCV值。值。37Channels (FL2-A)0306090120150ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: day1.001Date analyzed: 15-May-2007Model: 1DA0n_DSFAnalysis type: Automatic analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 76.51 % at 41.20 Dip G2: 5.19 % at 83.2

14、9 Dip S: 18.30 % G2/G1: 2.02 %CV: 4.19Total S-Phase: 18.30 %Total B.A.D.: 1.12 % Debris: 1.67 %Aggregates: 1.10 %Modeled events: 18232All cycle events: 17727Cycle events per channel: 411RCS: 3.507DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SFSC-H0306090120R1FL2-W0306090120R238 细胞凋亡的流式检测39凋亡与坏死凋亡与坏死 凋亡-细胞主动参与自身死

15、亡的过程。凋亡程序有一些特殊形态学特征，包括质膜的改变，如细胞膜不对称性和细胞附着消失，胞浆和细胞核固缩，核内DNA裂解。到了晚期，凋亡细胞断裂成“凋亡小体”，并很快被巨噬细胞清除，而不会引起周围细胞的炎症损伤 坏死-通常是由细胞损伤或细胞毒物作用引起，在形态学和细胞生物特性上，与凋亡有着本质的区别。坏死细胞的早期变化是细胞和线粒体肿胀，继而细胞膜破坏。不同于凋亡的是，坏死的细胞胞质内容物（多为蛋白水解酶）释放，会引起周围组织的炎症反应 40细胞凋亡检测方法 细胞凋亡检测的常用手段主要分为形态学检查、分子生物学方法、免疫电泳法和细胞学检查。其中，用流式细胞术研究细胞凋亡在技术和应用领域方面应用

16、日益广泛。由于可以对凋亡的多种特征多种特征进行快快速速、灵敏灵敏、特异特异的定性分析和定量分析，流式细胞术已经成为凋亡分析的重要检测手段。41流式细胞术检测细胞凋亡 细胞形态的变化 细胞质膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻导致的细胞膜不对称性消失 线粒体膜电位的改变 蛋白水解酶Caspase酶 的活化 核酸内切酶活化导致的DNA断裂 凋亡峰的检测42 细胞散射光变化 在细胞凋亡的初始阶段，细胞膜发生皱缩，导致FSC减小，而SSC增加或者维持不变434445 凋亡峰检测：在凋亡细胞中，利用流式检测PI染色后的DNA，可以发现一个亚群，称为A0细胞，该细胞DNA染色减少。研究者认为DNA染色减少的原因是因为

17、细胞内DNA的程序性减少，源于DNA片断化，而导致小分子量的DNA漏出照成的。凋亡峰检测凋亡峰检测PI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells46ProtocolsProtocols 用70%的乙醇固定细胞 1ml细胞悬液(1-5 X 106)均匀,快速混合于10ml预冷的70%乙醇中,置于4冰箱中2小时 从细胞中萃取出小分子量DNA 离心收集细胞,彻底去除乙醇,加入50ulDNA萃取缓冲液 置于37 水浴30分钟 离心细胞 加入1ml PI/RNAse染液,室温避光孵育30分钟 流式检测47磷脂酰丝氨酸的翻转磷脂酰丝氨酸

18、的翻转细胞发生凋亡时会有一系列的形态学特征性改变，其中，质膜的改变是早期凋亡的特征之一。细胞发生凋亡时，胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内侧翻转到外侧，暴露于细胞外表面。Annexin V是一个35-36kD的Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可以与细胞外暴露的磷脂酰丝氨酸结合。Annexin V标记上FITC、PE或生物素，可以在流式细胞仪上灵敏地检测凋亡细胞。 48Protocol 收集细胞，用预冷的PBS清洗细胞12次，然后用binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度在106/ml 取100ul细胞悬液，加入5ul Annexin V及5ul PI； 轻轻混匀，室温避光孵育15分钟 加入400ul binding buffer，流式检测4950Quadrant StatisticsFile: Data.004Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: Panel: Acquisition Date: 14-Dec-06Gate: No GateGated Events: 10000Total Events: 10000X Par