NK细胞杀伤活性检测

1、.1NK细胞杀伤活性检测细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法石河子大学医学院免疫学教研室石河子大学医学院免疫学教研室2013-7-5.2目的要求目的要求n熟悉乳酸脱氢酶释放法测定熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤细胞杀伤活性的检测方法。活性的检测方法。【原理】 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 (LDH)(LDH) 是活细胞胞浆内含酶之一。是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，正常情况下，LDHLDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDHLDH可释放至介质中。释放出来的可释放至介质中

2、。释放出来的LDHLDH在催化乳酸生在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶氧化型辅酶(NAD+)(NAD+) 变成变成还原型辅酶还原型辅酶(NADH2)(NADH2)。后者再通过递氢体。后者再通过递氢体- -吩嗪二吩嗪二甲酯硫酸盐甲酯硫酸盐 (PMS) (PMS) 还原硝基氯化四氮唑蓝还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)(NBT)，形成形成有色有色的甲臢类化合物，在的甲臢类化合物，在490nm490nm或或570nm570nm波长处波长处有一高吸收峰。利用读取的有一高吸收峰。利用读取的A A值，经过计算即可得值，经过计算即可得知知NKNK细胞杀伤靶细胞的活性。细胞杀伤靶细胞的

3、活性。实验原理实验原理 效应细胞效应细胞 靶细胞靶细胞 释放释放LDH 丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝.5【试剂】n1. 靶细胞靶细胞 检测人的检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株外传代细胞株K562。n2. 效应细胞效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。细胞。n3. 1640 培养液培养液n4. LDH 底物溶液（临用前配制）底物溶液（临用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝

4、 4mg NAD+I 氧化型辅酶氧化型辅酶I 10mg PMS 吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐 1mg.6【试剂】 加蒸馏水加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液溶解，混匀后取上清液1.6ml，加，加1mol/L 乳酸钠乳酸钠0.4ml，然后加入，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至至10ml。n5. 1% NP40 ： 取取1ml NP-40 加去离子水加去离子水99ml。n6. 1mol/L 柠檬酸终止液柠檬酸终止液 取柠檬酸取柠檬酸21g 加去离子水加去离子水100ml实验步骤实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备靶细

5、胞的制备效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用酶促反应酶促反应结果判读结果判读 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(K562), 洗涤洗涤3次（次（1000rpm10min）, 最后最后用完全用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓培养液调整细胞浓度至度至1105/ml, 备用。备用。靶细胞的制备：靶细胞的制备：效应细胞的制备效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）（分离外周血单个核细胞）采集静脉血采集静脉血4 ml，加，加0.2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250U/ml）抗凝）抗凝分别吸取分别吸取2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管

6、壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血离心离心2000rpm20min密度梯度离心分离淋巴细胞亚群密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入（加入0.2ml完全完全RPMI-1640 ，混匀，混匀，1x 107）将所得将所得PBMC用用5倍体积的倍体积的1640洗涤一次洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）计数计数PBMCPBMC1.1

7、.计数计数4 4个大方格中（即个大方格中（即6464个小方格）所有细个小方格）所有细胞数胞数2.2.计数原则：数上不数下，数左不数右。计数原则：数上不数下，数左不数右。3.3.总数除以总数除以4 4，所得数据，所得数据10104 4即为即为1ml1ml液体中的液体中的细胞总数细胞总数4.4.每每mlml健康成人血可分离出健康成人血可分离出1 110106 62 210106 6个个单个核细胞单个核细胞 计数计数PBMCPBMC举例举例n数数4 4个大方格细胞数分别为：个大方格细胞数分别为：8787，7979，9191，8585n总数为：总数为： 87+79+91+85=34287+79+91+

8、85=342n一个大方格的平均数为：一个大方格的平均数为：342/4=85.5342/4=85.5n1ml1ml液体中细胞量为：液体中细胞量为：85.585.510104 4n如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的据的2 2倍。倍。效效-靶细胞作用靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中, 每份标本设每份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml RPMI-1640液液)最大释放对照组最大释放对照

9、组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1NP-40液液), 1000r/min, 2min后后, 置置37、5CO2温箱温箱中孵育中孵育2-4h。A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组实验组 自然释放组自然释放组 最大释放组最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（靶细胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + .17【操作方法】n酶促反应酶促反应 ：从：从37温箱中取出培养物，吸取温箱中取出培养物，吸取各孔

10、上清各孔上清0.1ml 加于另一培养板孔中。加于另一培养板孔中。酶促反应酶促反应置置37预温预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应避光反应1015min。终止酶促反应终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12结果计算结果计算 用酶标检测仪在用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔波长下读取各孔OD值值, 并计算并计算NK细胞活性。细胞活性。实验组实验组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值NK细胞活性（细胞活性（%）最大释放对照组最大释放对照组O

11、D值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值=100%1、无论采用何种试验方法、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细应尽可能不吸动沉淀的细 胞。胞。4、用此法测得、用此法测得NK活性的正常值范围在活性的正常值范围在10-40%。注意事

12、项注意事项:.21实验报告实验报告 记录记录NKNK细胞杀伤实验的原理、方法、细胞杀伤实验的原理、方法、 结果。结果。.22 T淋巴细胞检查淋巴细胞检查.23E E花环形成试验花环形成试验【目的要求】【目的要求】1.1.掌握掌握T T淋巴细胞淋巴细胞E E花环试验的原理、正常值，花环试验的原理、正常值， 了解其方法和用途。了解其方法和用途。2.2.熟悉光镜下熟悉光镜下E E花环的形态和计数方法。花环的形态和计数方法。.24【实验原理】【实验原理】 T T细胞表面具有能与绵羊红细胞（细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBCSRBC）表表面糖肽结合的受体，称为面糖肽结合的受体，称为E E受体受体（CD2CD2）。）。已证已证实实E E受体是人类受体是人类T T细胞所特有的表面标志。当细胞所特有的表面标志。当T T细细胞与胞与SRBCSRBC混合后，混合后，SRBCSRBC便粘附于便粘附于T T细胞表面，呈细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查现花环状。通过花环形成检查T T细胞的方法，称细胞的方法，称为为E E花环形成试验花环形成试验。.25根据花环形成的多少，可测知根据花环形成的多少，可测知T T细胞的数目，细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。病的预后，考核药物疗效等。.26.