微生物药物产生菌菌种的保藏与质量控制

1、会计学1微生物药物产生菌菌种的保藏与质量控微生物药物产生菌菌种的保藏与质量控制制2微生物药物产生菌微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种管理微生物药物产生菌菌种管理微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种退化菌种退化微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种保藏与质量控制菌种保藏与质量控制主要内容主要内容微生物药物产生菌微生物药物产生菌主要包括细菌、放线菌和真菌。被描述的微生物药物大约近两万种。抗细菌:青霉素(Penicillin) P. notatum降血脂:他汀类(Statins) P. brevicompactum, A. terreus, Monascus ruber免疫抑制剂:环孢素(Cyclo

2、sporin A) Tolypocladium inflatum 抗真菌:棘白霉素类(Echinocandins) A. nidulans 一、微生物药物产生菌微生物药物产生菌二、微生物药物产生菌菌种管理二、微生物药物产生菌菌种管理对对 活活 纯纯 性状稳定性状稳定 微生物菌种实物管理 微生物菌种信息管理 保证菌种实物与信息的一致性菌种菌种一致一致菌种相关信息菌种相关信息入库入库菌株菌株菌种基本信息数据库菌种基本信息数据库保菌方法的研究保菌方法的研究与完善与完善确定保藏方式确定保藏方式-80 -80 低温冻结、冷低温冻结、冷冻干燥、液氮保藏冻干燥、液氮保藏实物库实物库出库出库录入相关保藏过程录

3、入相关保藏过程信息如保护剂、冻干曲线等信息如保护剂、冻干曲线等菌种入库数据库菌种入库数据库入库信息录入入库信息录入菌种入库实物库管理菌种入库实物库管理出库数据库出库数据库菌种实物菌种实物入库入库复核复份用户一致一致一致一致纯度检测纯度检测和复核鉴定等分类鉴定和复核鉴定等分类鉴定审核审核实物管理信息管理二、微生物药物产生菌菌种管理二、微生物药物产生菌菌种管理菌种的来源应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。 -2015版中国药典菌种菌种一致一致菌种相关信息菌种相关信息拟入库拟入库菌株菌株菌种基本信息数据库菌种基本信息数据库保菌方法的研

4、究保菌方法的研究与完善与完善确定保藏方式确定保藏方式-80 -80 低温冻结、冷低温冻结、冷冻干燥、液氮保藏冻干燥、液氮保藏实物库实物库出库出库录入相关保藏过程录入相关保藏过程信息如保护剂、冻干曲线等信息如保护剂、冻干曲线等菌种入库数据库菌种入库数据库入库信息录入入库信息录入菌种入库实物库管理菌种入库实物库管理出库数据库出库数据库菌种实物菌种实物入库入库复核复份用户一致一致一致一致纯度检测纯度检测和复核鉴定等分类鉴定和复核鉴定等分类鉴定审核审核实物管理信息管理 纯度检测和复核纯度检测和复核纯度检测和复核纯度检测和复核标准储备菌株标准储备菌株标准菌株工作菌株纯度检测和复核纯度检测和复核使用标准储

5、备菌株制备工作菌株标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行;标准菌株如果经过确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等或该菌株已无使用需要时，应及时灭菌销毁；标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 -2015版中国药典二、微生物药物产生菌菌种管理二、微生物药物产生菌菌种管理菌种菌种一致一致菌种相关信息菌种相关信息拟入库拟入库菌株菌株菌种基本信息数据库菌种基本信息数据库保菌方法的研究保菌方法的研究与完善与完善确定保藏方式确定保藏方式-80 -80 低温冻结、冷低温冻结、冷冻干燥、液氮保藏冻干燥、液氮保藏实物库实物库出库出库录入相关保藏过程录入相关保藏过程信息如保护剂、

6、冻干曲线等信息如保护剂、冻干曲线等菌种入库数据库菌种入库数据库入库信息录入入库信息录入菌种入库实物库管理菌种入库实物库管理出库数据库出库数据库菌种实物菌种实物入库入库复核复份用户一致一致一致一致纯度检测纯度检测和复核鉴定等分类鉴定和复核鉴定等分类鉴定审核审核实物管理信息管理微生物药物产生菌菌种退化 微生物药物产生菌经过多次传代或长期保持菌种的一个或多个优良特性逐步减退或消失，称为微生物药物产生菌菌种的退化。 三、微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化在实际生产中，培养条件的变化也会导致菌种形态和生理上的变化，但是只要培养条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此培养条件引起的菌种变

7、化是不能称为菌种退化的。 药用微生物产生菌菌种退化的鉴别微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化主要表现在微生物的形态、生理特性及微生物药物生产能力等方面的变化：1.细胞形态改变，产孢子能力下降。2.培养特征异常，典型性状变为不典型。3.对不良环境如低温、高温条件或噬菌体的侵染的抵抗力下降。4.营养需求发生改变。5.在生产上常见的退化现象有：微生物药物生产能力下降，生产的速度变慢。 三、微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化 防止微生物药物产生菌菌种退化的方法 三、微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化1.控制转接传代次数2.采用良好的培养条件3.采用有效保藏方法微

8、生物药物产生菌菌种退化的原因菌种退化的原因1.自发突变与回复突变2.细胞本身自我调节和修复3.环境条件的影响四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30）等方法保存；低于-70或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。-2015版 中国药典四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法安瓿管准备安瓿管准备酸洗酸洗水洗水洗蒸馏水蒸馏水

9、洗洗加标签及棉加标签及棉塞塞灭菌灭菌菌种菌种制备菌制备菌液液培养培养（固体或液（固体或液体）体）分装安瓿管分装安瓿管安瓿管预冻安瓿管预冻冷冻干燥开冷冻干燥开始始适当升温（促进适当升温（促进干燥）干燥）冻干结束冻干结束安瓿管封口安瓿管封口检查真空度检查真空度保护剂的选择与准保护剂的选择与准备备分装分装灭菌灭菌保藏（低温避光）保藏（低温避光）四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法2021-12-6 四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法202

10、1-12-6 四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法 -80度低温冻结保藏 液氮超低温保藏 存活率（%）活力（%） 存活率（%）活力（%）大观霉素产生菌69806280中生菌素产生菌70836788麦迪霉素产生菌808187772021-12-6 四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法保藏方法四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-影响保藏因素影响保藏因素四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-

11、影响保藏因素影响保藏因素四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-影响保藏因素影响保藏因素四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-影响保藏因素影响保藏因素据报道酵母合适的冷冻速度为3-10/min，乳酸菌为3-5/min，放线菌为1/min。使细胞在冻干过程中免于死亡或损伤，并减少在保藏过程中的死 亡；作为支持物和受体在复水过程中为干物质提供一定的骨架结构，防止复水时引起的死亡，并使菌体容易从休眠状态恢复为生长发育状态。 据报道适合的保护剂可以使微生物细胞的成活率接近99.8%。保护剂是保护性溶质，通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细

12、胞成分的构型，保护剂可替代结合水而稳定细胞的构型。对某些微生物，加保护剂反而有害。保护剂保护剂的作用的作用四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制- -保藏影响因素保藏影响因素很多菌种保藏机构如美国ATCC采用的保护剂多达有100多种。如脱脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常与其他物质混合使用。保护剂的种类保护剂的种类四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制- -保藏影响因素保藏影响因素 不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌生产能力的影响 牛奶牛奶 明胶明胶10%甘甘油油20%甘甘油油DMSOStreptomyces clavuliger

13、us 突变株 克拉维酸产生菌81%63%13%0.25%0.12%Streptomyces mycarofaciens 分离株 麦迪霉素85%60%76%38%74%Streptomyces mycarofaciens 突变株 麦迪霉素58%65%25%20%47%Streptomyces sp.（Streptomyces kitasatoensis）突变株 71%23%35%23%11%四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制- -保藏影响因素保藏影响因素 牛奶牛奶 明胶明胶10%甘甘油油20%甘甘油油DMSOStreptomyces clavuligerus 突变株

14、98%96%94%80%80%Streptomyces mycarofaciens 分离株83%60%80%82%73%Streptomyces mycarofaciens 突变株82%91%80%50%55%Streptomyces sp.（Streptomyces kitasatoensis）突变株85%57%85%不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌生产力的影响不同保护剂对冷冻干燥后抗生素产生菌生产力的影响 四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制- -保藏影响因素保藏影响因素四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-影响保藏因素影响保藏因素共晶

15、点的概念共晶点的概念四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-影响保藏因素影响保藏因素溶液随温度降低而发生凝固冻结，达到全部凝固冻结的温度称为凝固点或称共晶点。不同物质的凝固点不同。由于冻干是在真空状态下进行的，只有制品全部冻结后才能在真空下进行升华。保护剂与共晶点保护剂与共晶点四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏影响因素LyoprotectantLyoprotectantTeut (Teut (C)C)Tg (Tg (C)C)T prim. dr. phase (T prim. dr. phase (C)C)12% (w/v) sm161

16、82312% (w/v) sm + 7% (w/v) tr17253012% (w/v) sm + 7% (w/v) tr + 1% (w/v) Na-gl242934Eutectic Temperature, Glass-Transition Temperature, and Temperature Primary Drying Phase of Various Lyoprotectants Na-gl, Na-glutamate; sm, skim milk; Teut, eutectic temperature; Tg, glass-transition temperature; T p

17、rim. Dr. phase, primary drying phase; tr, trehalose. 共晶点的测定共晶点的测定四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏影响因素当温度降低时电阻增大，当降到共熔点时电阻即出现突然增大现象，此时的温度即是该溶液物质的共熔点。 1.保藏方法各个环节的细化和完善 降温速率的控制 保护剂 抗诱变剂的种类增多 共晶点测定 适合的冻干曲线2.玻璃化速冻 部分真菌保藏四、四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制质量控制-保藏方法新进展网址: http:/地址: 北京市天坛西里1号，中国医学科学院医药生物技术研究所邮编

18、: 100050微生物菌种购买和保藏, email: Tel: 01063161934微生物菌种鉴定email: Tel: 01083167110欢迎与我中心合作研究！38微生物药物产生菌微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种管理微生物药物产生菌菌种管理微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种退化菌种退化微生物药物产生菌微生物药物产生菌菌种保藏与质量控制菌种保藏与质量控制主要内容主要内容微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化主要表现在微生物的形态、生理特性及微生物药物生产能力等方面的变化：1.细胞形态改变，产孢子能力下降。2.培养特征异常，典型性状变为不典型。3.对不良环境如低温、高温条件或噬菌体的侵染的抵抗力下降。4.营养需求发生改变。5.在生产上常见的退化现象有：微生物药物生产能力下降，生产的速度变慢。 三、微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化 防止微生物药物产生菌菌种退化的方法 三、微生物药物产生菌菌种退化微生物药物产生菌菌种退化1.控制转接传代次数2.采用良好的培养条件3.采用有效保藏方法微生物药物产生菌菌种退化的原因菌种退化的原因1.自发突变与回复突变2.细胞本身自我调节和修复3.环境条件的影响四、微生物药物产生菌菌种微生物药物产生菌菌种质量控制