酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定

1、酶促反应动力学实验 影响酶促反应速度的因素酶促反酶促反应速度应速度底物底物浓度浓度酶浓度酶浓度pH值值抑制剂抑制剂激活剂激活剂温度温度酶浓度对反应速度的影响正比例正比例关系关系底物浓度底物浓度酶浓度酶浓度酶被底物酶被底物饱和饱和温度对反应速度的影响v一方面是温度升高一方面是温度升高,酶促反应速度加快。酶促反应速度加快。v另一方面另一方面,温度升高温度升高,酶的高级结构将发酶的高级结构将发生变化或变性，导生变化或变性，导致酶活性降低甚至致酶活性降低甚至丧失。丧失。 v在最适温度条件下在最适温度条件下,反应速度最大。反应速度最大。pH 对反应速度的影响在一定的在一定的pH 下下, 酶具有最大的催化

2、活性酶具有最大的催化活性,通常称通常称此此pH 为最适为最适 pH。激活剂对反应速度的影响激活剂对反应速度的影响必需激活剂，必需激活剂，大多为金属离大多为金属离子，子，Mg2，K，Mn2，等，等酶的激活剂酶的激活剂非必需激非必需激活剂活剂抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性降低或消失。抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。不可逆性抑制作用可逆性抑制作用抑制剂对反应速度的影响Km, Vmax降低降低Vmax降低降低竞争性非竞争性反竞反竞争性争性Km增大可逆性抑制作用底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响高低反应速度和底物

3、浓度成正比关系酶活性中心被底物饱和反应速度增幅下降单底物、单产物反应酶促反应速率一般在规定反应条件下，用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小(5%)时的反应速率。底物浓度远远大于酶浓度。研究前提研究前提矩形双曲线矩形双曲线 nKm 即为米氏常数，即为米氏常数，nVmax为最大反应速度为最大反应速度n当反应速度等于最大速度当反应速度等于最大速度一半时一半时,即即V = 1/2 Vmax, Km = S n上式表示上式表示,米氏常数是反应米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底速度为最大值的一半时的底物浓度。物浓度。n因此因此,米氏常数的单位为米氏常数的

4、单位为mol/L。米曼氏方程式米氏常数Km的意义v不同的酶具有不同不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重值，它是酶的一个重要的特征物理常数。要的特征物理常数。vKm值只是在固定的底物，一定的温度和值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的同条件下具有不同的Km值。值。vKm值表示酶与底物之间的亲和程度值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值值大表示亲和程度小，酶的催化活性低大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。酶的催化活性高。 Vmax定义：定义：Vm是酶完全被底

5、物饱和时的反应速度，是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。与酶浓度成正比。意义：意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算计算 酶的酶的转换数转换数(turnover number)，即动力学常数即动力学常数K3。米氏常数的求法1V= =KmVmaxS11+ +Vmax V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度 S表示底物浓度 Km表示米氏常数双倒数作图法底物浓度对酶活性底物浓度对酶活性的影响的影响碱性磷酸酶Km值的测定v米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利

6、用实验求出常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。的方法。实验原理磷酸苯二钠碱性磷酸酶H2OpH=10.0，37酚Na2HPO4酚试剂酚试剂（磷钼钨酸）（磷钼钨酸）OH蓝色化合物650nm吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。v1酚试剂v22.5mmolL磷酸苯二钠基质液 v3碱性缓冲液(pH-10.0)v4碱性磷酸酶液试剂试剂试剂(ml)123456782.5mM磷酸苯二钠0.20.30.40.50.60.81.01.0蒸馏水0.80.70.60.50.40.2-碱性缓冲液1.01

7、.01.01.01.01.01.01.0混匀后，370C水浴 5 min碱性磷酸酶液0.10.10.10.10.10.10.1-混匀后，370C水浴 15 min（准确计时）酚试剂1.01.01.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶液-0.110 Na2CO33.03.03.03.03.03.03.03.0操作取8支试管，按下表加入试剂。 混匀后，37水浴15min，以第8管调节零点，在650nm波长处进行比色，读取各管A值。管号A6501/A650S1/S1234567处理结果以1/A650对1/s按Lineweaver-Burk作图法作图，求出碱性磷酸酶的Kmv 在竞争性抑制中，酶不

8、能同时和底物、抑制剂结合，在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成即不能形成EIS，I竞争结合酶活性中心，其动力学特征竞争结合酶活性中心，其动力学特征是：米氏常数的表观值是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度增加，酶的最大反应速度Vm不变。不变。 v 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成成EIS， I结合酶活性中心以外部位，不影响结合酶活性中心以外部位，不影响E与与S之间之间的结合，但是的结合，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特不能进一步转变为产物，其动力学特征是：征是：Vm降低而降低而Km不变。不变。v 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成才能和酶结合形成EIS，其动