几个常用启动子

1、几个常用的启动子和诱导调控表达系统1.最早应用丁的表达系统的是 Lac乳糖操纵子，由启动子lacP +操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAM调控和lacI负调控。2.lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平 上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白， 能结合在操纵基因lacO上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI 产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成 为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平

2、更高，比lacUV5更优越。4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转 录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的 lac操 纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选 为 Lac/Tac/trc 表达系统的表达菌株。现在的 Lac/Tac/trc 载体上通常还带有 lacIq 基因.以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。6.IPTG广泛用丁诱导表达系统，但是IPTG有一

3、定蠹性，有人认为在制备医疗目的 的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替 IPTG作为诱导物的研究。另外一种 研究方向是用lacI的温度敏感突变体,30C下抑制转录，42C开始发挥作用。 热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而 影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影口向产物的稳定。7.以入噬菌体转录启动子PL、PR构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子 受控丁入噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用丁 调控PL、PR启动子的转录。同样也是30C下阻遏启动子转录，42CT解除抑制 开始转录。同样的

4、，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常 见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因,所以可以有更大的宿主选择范围。另 外一种思路是通过严谨调控 cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如 Invitrogen 的PL表达系统，就是将受 trp 启动子严谨调控的 cI基因溶源化到 宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。8.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动孑 经过巧妙的设计而成为原核表达的首选、 尤其以 Novagen公司的pET系统为杰出 代表。强大的T7启动子

5、完全专一受控于 T7 RN麻合)，而高活性的 T7 RNA聚 合酶合成mRN物速度比大肠杆菌RNA合酶快5倍一一当二者同时存在时，宿 主本身基因的转录竞争不过 T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的 也L;诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50咖上。由丁大肠杆菌本身不含T7 RNA聚合酶，需要将外源的T7 RNA聚合酶引入宿主菌， 因而T7 RNA聚合酶的调控模式就决定了 T7系统的调控模式一一非诱导条件下， 可以使目的基因完全处丁沉默状态而不转录， 从而避免目的基因毒性对宿主细胞 以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA聚合酶的量,就可以控制产物表达量

6、,某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用丁调控T7 RNA聚合酶的合成，从而调控 T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体 的衍生株，含有lacI抑制基因和位丁 lacUV5启动子下的T7 RNA聚合酶基因。 DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac 一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿 主细胞的潜在蠹性而造成的质粒不稳定。然后用入CE6噬菌体侵染宿主细胞 CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变（cI857ts）和pL

7、/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供 T7 RNA聚合酶。比如有人用受溶氧浓度 控制的启动子 调控T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。 由丁 T7 RNA聚合酶的调控方式仍有可能 有痕量的本底表达，控制基础表达的手 段之一是培养基外加葡萄糖，有助T控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体-一在紧邻T7启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白（lacI） , lac阻遏蛋白可以作用丁宿主染色体上 T7 RNA聚合酶前的 lacUV5启动子并抑制其表达，也作用丁载体T7 lac启动子，以阻断任何T7 RNA 聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。如果这还不够，更 为严谨调控手段还有一一在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA聚合酶的基因一一T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE,相容的 ori 都不会影口向后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平