芯片在皮肤研讨中的实用性

1、芯片在皮肤研讨中的实用性QPCR芯片基本原理及相关应用每张 QPCR芯片如同上百个 QPCR微反应池的集成 , 每个微反应池都固定有基因特异性引物 , 当加入含有模板和荧光基团的 QPCR反应体系后 , 在相同的反应条件下 , 不同的基因都能同时进行特异性扩增 , 每个微反应池的位置信息就代表了某个特定基因 , 利用荧光信号的积累实时监测每个微反应池中 PCR反应的过程 , 最后通过标准曲线就能同时对上百个基因 mRNA或 cDNA进行准确定量分析。与基因芯片相比 ,QPCR芯片的通量显着减低 , 一次至多检测 96 个或 384 个基因 ,基本相当于基因芯片通量的 1%,但是 QPCR芯片的

2、扩增对象经过仔细选择 , 是某一组织或病变类型高度相关的基因 , 更便于数据的分析处理 , 检测基因还可以随研究需要加以改动 , 便于操作 , 而且价格比较低廉。基因芯片和 QPCR芯片的原理不同 , 但对于基因表达谱而言 , 他们的检测对象 (mRNA或 cDNA)到实验结果 ( 表达丰度 ),QPCR与基因表达芯片都高度一致 , 许多研究者都把这两种方法作为互相印证的手段 , 而对于几十个甚至几百个基因的表达丰度检测 ,QPCR技术完全可以取代基因芯片。基因芯片通过对来源于不同个体 ( 正常与患者 ) 、不同组织或不同发育阶段组织细胞内的 mRNA(经逆转录后产生的 cDNA)进行检测 ,

3、 可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性等进行综合的分析与判断 , 迅速将某个或几个基因与病变起来 , 也为进一步研究基因间相互作用关系提供参考。那么中等通量的 QPCR技术是否能够解决同样的问题呢 ?答案是肯定的。计算机预测是将基因表达水平的数据与分子信号过程进行的关键步骤。 目前广泛运用的软件是根据基因表达量的变化 , 计算机结合已知信号通路的信息 , 将“宏观表型”与分子信号过程结合。由于这一软件预测的基础是已知信号过程 , 并不能预测新的未知信号过程 , 所以对基因芯片的海量数据的利用率有限。 而在 QPCR芯片的设计过程中 , 研究者依据已知的信号过程选择检测对象

4、 , 尽管选择的基因总数不多 ,但可能都是预测软件的参考基因 , 同样会得到较好的结果。在当今生物科学和医学领域 ,QPCR作为一种新型实用研究工具得到了越来越高度的重视 , 其使用量逐年上升 , 但是 QPCR芯片技术的应用才刚刚处于起步阶段。 有关学者开始利用 QPCR 芯片技术进行多领域医学研究 , 取得了有突破性意义的成果。 , 等认为雌激素天然衍生物 2- 甲基雌二醇作为 (2-me-thoxyestradiol,2ME), 在临床试验中是乳腺癌一个重要的评价对象。他们在两种治疗组中通过 QPCR芯片技术测试鉴定了 Dox 细胞毒性单独处理和协同 2ME处理后细胞的基因表达差异。 其

5、研究主要目标是评估 2- 甲基雌二醇在对阿霉素多耐药性乳腺癌细胞 (MCF-7/Dox) 产生的调节影响及其潜在的作用机理。 IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco 等认为IL-12RB2 在人类 B 细胞恶性肿瘤中是最为肿瘤抑制基因存在作用的。大鼠 IL-12基因敲出后自然产生了 B 细胞恶性肿瘤 , 而且有了肺上皮细胞肿瘤。但是 IL-12 没有能力对表达 IL-12 受体的 B16 黑色素瘤细胞有直接作用。他们利用 QPCR芯片对大鼠 IL-12 基因正常组和敲出组进行测试 , 发现 IL-12 能通过抑制血管生成来降低表达 IL-12 受体的 B16

6、细胞的致瘤性。 AndreasHald,BirgitteRono 等认为除了在宿主防御方面表现明显的重要性 , 巨噬细胞已经被证明在不同的病态条件 , 包括慢性炎症、动脉粥样硬化和癌症中扮演一个有害的作用。而巨噬细胞活化和迁移与细胞外基质降解密切相关。这个过程可以通过多个蛋白水解酶完成。在这项研究中 , 他们利用 QPCR芯片进行分析 , 发现 LPS诱导基质金属蛋白酶的表达 , 同时降低基质金属蛋白酶抑制剂的表达。 此外 , 基因间的比较的表达水平相关的蛋白酶透露他们之间存在较大的差异基因表达水平 , 凸显了巨噬细胞的基因表达调控的复杂性。 除了这些文章还有学者分别对病原微生物检测、 炎症反

7、应研究11 等方面进了相关研究 , 得到了很好的研究成果。QPCR芯片在皮肤科学中的应用前景在皮肤科学研究中 , 被毛突变小鼠都是用来研究人类同源基因疾病良好的动物模型。国内外研究者已获得了 20 多个被毛突变系小鼠 , 如在皮肤、免疫及肿瘤领域得到广泛运用的裸小鼠 12; 表皮病变引起被毛异常的 hr 小鼠和 ic 小鼠 13; 章金涛等的豫医无毛小鼠 14; 李善如等发现的被毛突变无毛小鼠 15 等等。通常认为毛发多少与毛囊数量及毛囊发育周期相关 , 许多研究集中在毛囊本身及毛囊与皮肤微环境信号分子的相互关系上 , 如 hid 和 sa 等基因直接作用于毛球 , 引起毛发发育障碍 16,

8、而经过皮肤病理学家 JohnSundberg 博士的鉴定 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠皮肤的主要病变是过度角化 , 导致毛发生长困难 , 毛囊的数目并未显着减少、主要形态结构基本正常。因此 ,snthr-1Bao 小鼠和 hr 等小鼠一样 , 是表皮角化、毛发阻生、皮肤慢性损伤并发无菌性炎症的理想模型。仅从组织病理学来看 ,snthr-1Bao 稀毛突变小鼠皮肤的原发病变与人类 Alagile 综合症比较相似。 Alagile 综合症为常染色体隐性遗传性疾病 , 临床表现为头皮斑秃和全身广泛毛发稀少 , 性腺功能减退 , 身材发育延迟等 ; 病组织理表现为表皮轻度棘皮病样改变 , 角化过度

9、而深入毛孔形成角栓 , 但目前该病分子机制尚未完全清楚 17, 需要开发出相应的模型进行分子水平上的研究。“皮肤表达关键基因 QPCR芯片”可以为这方面的研究提供了一种新的尝试。 从 QPCR芯片开发的角度 ,snthr-1Bao 稀毛小鼠也是待开发的“皮肤表达关键基因 QPCR芯片”很好的试验对象 , 可以为芯片的设计、优化及将来的推广应用提供了最直接的检验。再例如在皮肤科学中 , 瘢痕疙瘩是在皮肤创伤愈合过程中成纤维细胞过度增殖和胶原过度分泌所致的病理性瘢痕 , 目前尚无确切有效的药物。众多学者通过大量基础实验研究和临床证据表明 , 瘢痕疙瘩的发生机理与多个基因的功能活动密切相关。 Smi

10、thJC,BooneBE,OpalenikSR18 等通过使用 QPCR研究发现降低 Wnt 信号表达的多种抑制因素对瘢痕疙瘩成纤维细胞表面这个基因的作用。 同时发现在正常细胞中的诱饵受体 IL-13R 2 是低表达 , 在瘢痕疙瘩中几乎不存在。得到QRT-PCR证实的有用结论是 , 支持在瘢痕疙瘩治疗中提高 IL-13 的活性。 Chang等 .(20XX)19 通过研究发现 HOX基因在发育的胚胎阶段有重要作用 , 能够调节人的分化细胞 , 包括人类的真皮纤维母细胞 , 不同的 HOX基因表达可能成为组成瘢痕疙瘩的恶性表型。 魏斌 , 范金财等 20 运用 RNAi 干扰正常皮肤成纤维细胞前列腺素内过氧化物合酶 2(PTGS2)基因的表达 , 利用 realtimeRT-PCR 验证 siRNA沉默效果 ; 应用全基因组芯片检测基因表达谱变化。 检测到与 PTGS2基因相关的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同发挥作用的相关基因 , 证明 PTGS2与瘢痕疙瘩的发病机制有着密切的关系 , 为治疗瘢痕疙瘩提供了一个潜在的候选靶点。BockO,YuH,ZitronS21 研究了 beta1-3 和它们的受体 IandII 对皮肤纤维原细胞的影响。其他的一些基因 , 包括 IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色体臂