功能标记开发与定位（课堂PPT）

1、1第二章 功能标记开发与定位第一节 功能标记的概念与种类第二节 功能标记开发第三节 功能标记定位2第一节 功能标记的概念与种类 DNA标记多态性分子基础示意图 3分子标记在染色体上的分布5UTR3UTR重复区域重复区域内含子内含子外显子外显子基因代表标记41.1 功能标记的概念 又称诊断标记，是基于生物功能已知的引起表型变异的基因内部序列多态性位点开发的分子标记。前提是目标基因的生物学功能已经明确。分子标记分子标记性状性状基因基因重复序列重复序列同源基因同源基因功能已知功能已知功能未知功能未知连锁标记连锁标记功能标记功能标记基因标记基因标记51.2 功能标记的种类 1.2.1 SRAP标记 S

2、equence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性。 原理：利用独特的引物设计对ORFs 进行扩增， 上游引物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。 因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。内含子内含子外显子外显子外显子外显子内含子内含子正向引物反向引物61.2.2 SRAP标记程序 1 引物设计 上游引物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。上游引物下游引物5 TGAGTCCAAACCGGATA 35

3、GACTGCGTACGAATTAAT 35 TGAGTCCAAACCGGAGC 35 GACTGCGTACGAATTTGC 35 TGAGTCCAAACCGGAAT 35 GACTGCGTACGAATTGAC 35 TGAGTCCAAACCGGACC 35 GACTGCGTACGAATTTGA 372 反应体系及条件 反应体系：20L 30 ng DNA 模板, 引物各0.3 mol/L, dNTPs 200 mol/L, 1 PCR buffer, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。 反应条件： 94变性5 min, 1 个循环; 94变性

4、1 min, 35复性1 min, 72延伸 1 min, 5 个循环; 94变性1 min, 50复性 1 min., 72延伸1.5 min,35 个循环; 72延伸 5 min83 产物检测及图谱分析 4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳94 特点 共显性标记系统 多态性强 DNA需要量少 简单且花费少 标记分布均匀 缺点：若未利用扩增区域序列的任何信息，则产生的标记是随机分布的，严格地说，不是功能标记。若针对某一特定基因设计SRAP引物，则标记为功能标记。101.2.3 TRAP标记 Target Region Amplified Polymorphism，目标区域扩增多态性，或靶位区域扩增多态

5、性。 原理：是利用生物信息工具和EST 数据库信息, 产生目标候选基因区多态性标记。TRAP技术采用两个18 核甘酸引物产生标记, 一个为固定引物, 依据EST 序列设计; 另一个为随机引物, 针对外显子和内含子的特点, 设计为分别富含GC 或AT 核心区的任意序列。111 引物设计 TRAP技术采用两个18 核甘酸引物产生标记, 一个为固定引物, 依据EST 序列设计; 另一个为随机引物, 针对外显子和内含子的特点, 设计为分别富含GC 或AT 核心区的任意序列。内含子内含子外显子外显子外显子外显子内含子内含子反向引物正向引物122 反应体系及条件 反应体系：20L 40 ng DNA 模板

6、, 引物各0.25 mol/L, dNTPs 200 mol/L, 1 PCR buffer, 15 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。 反应条件： 94变性5 min, 1 个循环; 94变性1 min, 35复性1 min, 72延伸 1 min, 5 个循环; 94变性1 min, 50复性 1 min., 72延伸1.5 min,35 个循环; 72延伸 5 min133 产物检测及图谱分析 6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳141.2.4 PCR-DGGE标记 基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳标记。 原理：根据功能基因结构域基序单核苷酸多态性设

7、计引物进行特异扩增，然后将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。15PCR 程序 巢式或半巢式PCR：touch dowd 94 变性4 min ; 退火20 个循环(94 1 min , 6556 1 min ,72 1 min , 2 个循环降1 ); 延伸10 个循环(94 1 min ,55 1 min ,72 1 min); 续延伸，72 6 min.16图谱分析 针对16s rDNA结果17葡萄糖262磷酸脱氢酶( G6PD)18急性白血病胸苷酸合成酶( TS)191.2.5 其它功能标记 针对内含子扩增的： IFLP：内含子片段长度多态性 ISAP：内含子序列扩增多态性 SSCP-S

8、NP：基于SNP的单链核苷酸构象多态性 针对启动子扩增的： PRAP：启动子区域扩增多态性 针对外显子扩增的： STS：序列标签位点 RGA：抗病基因类似序列20SSCP-SNP21SSCP-SNP插入缺失区检测微卫星区检测22simple sequence repeatfunctional domain marker (SSR-FDM)23与水稻籽粒长度高度相关的GS3基因第二外显子单个SNP（CA）功能标记 水稻GS3基因第二exon单个核苷酸由C突变成突变成A导致籽粒增长。导致籽粒增长。24第二节 功能标记开发 原理：基于已知功能基因序列变异区设计引物进行特异扩增，扩增产物唯一或者能容易

9、与其他基因区分。 一个基因结构中，变异较大的是内含子区， 5UTR，3UTR，外显子比较保守外显子比较保守。25EXONINTRONCDS (coding sequence)ORF (open reading frame)26STS 功能标记开发 1 获得某一已知功能的基因序列 2 同源序列或等位基因比较获得变异区序列 3 针对变异区设计引物 4 特异扩增 5 图谱分析，差异条带寻找 UniGene 数据库数据库（ /UniGene/ ）27建立特定染色体的基因组文库建立特定染色体的基因组文库随机选择克隆进行短片段单次测序随机选择克隆进行短片

10、段单次测序比对确认不含重复序列比对确认不含重复序列在序列上寻找引物在序列上寻找引物合成引物对基因组合成引物对基因组DNA进行进行PCR产物为单一片段即是产物为单一片段即是STS标记，确标记，确认其在染色体上的位置认其在染色体上的位置如如何何找找到到一一个个STS2829举例：PPO基因STS功能标记开发302A染色体上PPO基因STS标记的分子基础312A染色体上PPO基因STS功能标记322D染色体上PPO基因STS标记的分子基础332D染色体上PPO基因STS功能标记713bp490bpPPO29与PPO16是一对互补标记，即，用PPO29扩增，高活性品种均能扩出490bp条带，低活性品种扩不出条带；用PPO16扩增，低活性品种均能扩出713bp条带，高活性品种扩不出条带。34第三节 功能标记定位353.1 非整倍体定位技术 即用功能标记的特异引物对相应非整倍体物种基因组进行扩增分析，若哪一条染色体或染色体臂未被扩增出目标条带，则标记被定位在该染色体或染色体臂上。36373.2 连锁标记技术 即，寻找与功能标记紧密连锁的分子标记，计算重组率，将功能标记定位在连锁图谱上。一般所用分子标记是SSR标记。38393.3 FISH技术 即，用功能标记扩增得到的序列作探针，与基因组染色体进行荧光原位杂交，有杂交信号的染色体即