DNA体外重组技术

1、1会计学DNA体外重组技术体外重组技术DNA克隆(DNA cloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA 。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning)。 “克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。 实现DNA克隆所用的方法

2、及相关的工作称DNA重组技术(recombinant DNA technology)，又称基因工程(genetic engineering)。 基因工程目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取连接物（重组DNA)导入合适受体细胞目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建重组体的筛选克隆基因的表达 分、切、接、转、筛（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、载体的分类克隆型载体表达型载体原核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）原核克隆型载体原核表达型载体真核转递型载体真核表达型载体质粒载体噬菌体载体病毒载体

3、酵母人工染色体载体粘性载体细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义: 是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1. 质粒(plasmid)的特征克隆用质粒载体应具备的特点：2. 质粒载体的分类: 克隆载体和表达载体（1）克隆用质粒*lac Z N端146 aa残基编码基因*lac Z编码产物为半乳糖苷酶片段（N端）,突变型lac E. coli可表达该酶的片段（C端)，两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性-蓝色化合物 互补（ complementation）*在Lac Z 基因内无外源

4、DNA的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落-阴性克隆。 *在Lac Z 基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落-阳性克隆。X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因互补筛选-蓝白斑筛选外源DNA插入白色IPTG诱导异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类似物阴性克隆阳性克隆AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr, Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。Pst I, BamH I：两个单酶切位点用于插入目的基因AmprLacZMCSpfxBlue: 克隆质粒MCS：Mul

5、tiple Cloning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)OriAva I (413)Bam HI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCS*pUC18/pUC19的MCS方向相反pMD-18 T simple克隆载体的结构 pET-32a(+)原核表达载体的结构 *pET系列的基本结构：T7启动子、MCS、T7终止子、Ampr等Amprl

6、ac*可将T7 RNA聚合酶基因置于lac启动子的控制下pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子 驱动目的基因在真核细胞内表达BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区调控区裂解区cos末端 cos 末端ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型 噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。 噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的DNA

7、分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。 噬菌体的种类：Charon系列、 gt系列、EMBL系列（四） 酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵母基染色体中心粒端粒复制起点顺序复制起点(ori)Ampr基因组成用途构建真核生物基因组DNA文库能携带更大（1Mb）的插入片段第二节基因工程中常用的工具酶一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H定义：切基因工程的手术刀、（基因工程技术中常用型） 切基因工程的手术刀分类：一、限制性核酸内切

8、酶命名：Hin d 属 种 株 序Haemophilus influenza d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶类酶识别序列特点 识别顺序一般为46个碱基，通常为回文结构(palindrome)(核苷酸序列呈二元旋转对称,180反向重复）切口 ：平端切口、粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口粘端切口平头或钝性末端（blunt end) 粘性末端（sticky end) 产生5 突出黏性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHP

9、 A A T T C* G*5335P OH 产生3 突出黏性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*53535335OHP*C T G C A*G5335OHPA C G T C*G*酶单位定义： 在适当反应条件下，1h内在50l体系中完全酶解1g特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。 出售的内切酶几乎均以噬菌体DNA作底物测其酶活性单位。酶切鉴定 ：琼脂糖凝胶电泳含3种酶活性：1. 大肠杆菌DNA聚合酶I 催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5 3外切酶活性)-主要用途 DNA序列分析应用：2. Klenow片段 随机引物标记法标记探针-主要用途 双脱氧末端终止法进行DNA测序

10、 cDNA第二链的合成 DNA 3突出末端进行末端标记用途：(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段， 缺5 3外切酶活性) #38. 323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 5核酸外切酶活性DNA聚合酶活性 N 端C 端枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 PCR反应-主要用途 DNA测序用途：3. Taq DNA聚合酶(65kD)耐热， 在7075时具有最佳的生物活性， 无3 5外切酶活性(无校正功能） #40. 35外切酶活性的功能校读（proofread）功能17/62将错配的核苷酸从引物链

11、的3端除去 （1）反转录活性：即以RNA为模板合成DNA(主） （2）RNase H活性：水解RNA-DNA中的杂合 分子中的RNA（3）DNA-pol活性：以DNA为模板合成DNA 4. 反转录酶(Reverse Transcriptase, RT)二、DNA聚合酶反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板反转录活性DNA-RNA 杂化双链RNase H活性单链DNADNA-pol活性双链DNA *催化双链DNA相邻碱基5-P和3-OH间磷酸二酯键形成的酶。*T4噬菌体DNA连接酶-最常用 催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端) 5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键。*主要功能与用途：催化平

12、末端连接要比粘性末端 效率低得多。修复双链DNA分子中单链缺口。功能： 催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3-OH末端。(一) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2. DNA 3末端的同位素标记。催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。用途：1. 在连接反应中去除载体DNA片段5-P，防止载体自我连接.2. 用32P标记5末端时，用此酶去除5-P，再用激酶进行5的 32P标记.(二) 碱性磷酸酶功能：第三节目的基因的获得和修饰-分一、采用限制性内切酶酶切法直

13、接分离目的基因1.从原核基因组中制备2.从真核基因组中制备二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因1.获得已知的基因2.构建RT-PCR文库法并获得未知基因3.计算机克隆三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选基因组文库(genomic library，G文库)： 将基因组DNA用内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，再将其导入适当的宿主细胞， 宿主细胞中克隆载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。G文库构建方法：鸟枪法分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌从基因组DNA文库获

14、取目的基因 cDNA文库(cDNA library，C文库)： 将细胞内所有mRNA 逆转录为cDNA，再将所有cDNA片段克隆到适当的载体中 ，并将其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是C文库。C文库构建方法： 反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 *由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。四、化学合成法制备基因片段*已知序列用DNA合成仪 本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因

15、。缺点： 2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。 1. 只能合成较小片段的DNA第四节目的基因的载体连接-接，分子克隆的核心*利用目的片段所特有的限制性内切酶识别位点对产物进行酶切分析。*在设计PCR引物时要考虑到连接方式，直接在引物的末端包含与载体相匹配的限制性内切酶位点。35T载体35载体T3535AAPCR产物一、PCR产物的克隆策略PCR扩增+335PCR产物AA5T载体TT5533连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATP*不需酶切*不受酶切位点的限制用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的

16、基因适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端高背景(自身环化)双向(正、反)插入单酶切缺陷二、外源DNA片段和载体的连接#58. Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶16C 16 hGATCC GGCCTAG目的基因用 Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连载体自连

17、同一限制酶切位点连接如何实现？质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端而进行粘端连接。 DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点第五节重组分子的扩增和鉴定BTX ECM 2001多功能细胞融合仪 方法：

18、磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔法 脂质体转染 显微注射 非转化子转化子非重组体重组体鉴定单抗生素筛选非转化子(不能生长）转化子阳性重组体自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体二、重组DNA分子的筛选、鉴定（一）抗生素筛选仅作为初步筛选AmprTetr插入失活的双抗生素对照筛选法*若目的基因插入抗生素抗性基因外部，重组质粒能在含该抗生素的培养基上生长*若目的基因插入抗生素抗性基因内部，即引起插入失活，重组质粒不能在含该抗生素的培养基上生长BamH IDNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPst I目的基因与pBR322经BamH I酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？思考

19、题用BamH I酶切(插入失活法) 抗药性标记选择在tetr（TcR)中插入外源DNAampr插入失活的双抗生素对照筛选法克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆TetTet平板123456789101112123456789101112AmpAmp转化子非转化子(不能生长)(三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶酶切鉴定快速小量提取质粒DNA跑得慢-重组质粒跑得快-空载体（二）X-gal筛选-蓝/白筛选 见于pUC系列、 pEGM系列、M13蓝色菌落：阴性克隆 白色菌落：阳性克隆 #75 互补利用互补原理筛选重组体pUC18 重组CK2 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11

20、,12,13号克隆是阳性克隆; 第4,6,8号是阴性克隆1. DNA/EcoR I+Hind 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III 重组质粒的酶切鉴定 *通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点-通用引物 *对于表达型重组子，插入片段必须是正确的序列，一般要进行DNA测序ABI PRISM 310型 DNA测序仪主要用于DNA序列分析（五）其他方法内切酶重组DNA目的基因分离电泳印迹到NC膜探针放射性非放射性分子杂交核酸分子杂交覆盖滤

21、膜取下沾有菌落的滤膜 裂解、 变性、固定等与探针杂交放射性自显影1 2 34 5 63和5是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交用已知的特异抗体检测目的基因蛋白免疫化学检测（Western blot)重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体细胞筛筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因文库 内切酶化学合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主鉴定（酶切电泳、序列分析、杂交、Western blot等）筛选 (抗生素、X-gal 等法)阳性重组体表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化 外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻