SDS-PAGE具体步骤

1、（一）安装夹心式垂直版电泳糟各部分依下顺序安装：装上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上；将长、短玻璃板分别插到硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面，以保持玻璃清 洁；将已插好玻璃板的凝胶模平方在储槽上，短玻璃板应面对上储槽；将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽，用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶膜间的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用不连续体系电极缓冲液 配制。（二）配胶及凝胶板的配制1、配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。2、凝胶板的配制分离胶的制备：按表配制20m

2、L10%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内，约8cm高，用1mL注射器取少许蒸储水，沿长玻璃板壁缓慢注入，约34mm高，以进行水封。30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则 表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸储水，再用滤纸条吸去多余水分。浓缩胶的制备：按表配制10mL3%的PAA,混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约 0.5cm处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置2030min ,使凝胶"老化"。小心拔去样品槽模板，将 pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲

3、液倒入上、下储槽中，应没过短玻璃板0.5cm以上，即可准备加样。（电极缓冲液即 pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，内含 0.1%的SDS）（三）样品的处理与加样样品的处理：称取0.51mg蛋白质加1mL样品溶解液处理，溶解后，在 100摄氏度沸水浴中保 温3min,取出冷却后取样电泳。（如处理好的样品暂时不用， 可放在-20摄氏度冰箱内保存， 使用前在100摄氏度沸水中加热 3min,以除去亚稳态聚合物。）加样：（加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为1015uL（即210ug蛋白）；如样品较稀，加样体积可达100uL。如样品槽中有气泡，可用注射器针头跳出。）加样时，将

4、微量注射器的针头穿过电极缓冲液深入加样槽内，应尽量接近底部，轻轻 推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。（由于样品溶解液中含有相对密度较大的蔗糖或甘油，因此，样品溶液会自动沉降在凝胶表面而形成样品层。）（四）电泳（分离胶聚合后是否进行预电泳，这应根据需要而定。）在电极槽中倒入 pH值为8.3的Tris-HCl电极缓冲液（内含0.1%的SDS）即可进行 电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏胶中的pH值环境，预电泳只能在分离胶聚合后进行， 应采用分离胶缓冲液。 预电泳后，将分离胶面冲洗干净， 然后才能制 备浓缩胶。电泳条件也不同于连续系统，开始时电流为10mA左右；待样品进入分

5、离胶后，改为2030mA ;当燃料前沿距硅胶框底边 1.5cm时，停止电泳，关闭电源。（五）凝胶板的剥离与固定电泳结束后，取下凝胶膜，卸下硅胶框，用镶子撬开短玻璃板，并切下凝胶板的 一角作为加样标志。在两侧漠酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在 大培养皿内，加入固定液，固定过夜。（六）染色与脱色将染色液倒入培养皿中，染色 1h左右，用蒸储水漂洗数次，再用脱色液脱色， 直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。（七）绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出漠酚蓝区带中心距加样端的的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），按下式计算相对迁移率（mR）:相对迁

6、移率=蛋白质样品区带中心与加样端的距离（ cm ） /漠酚蓝区带中心加样端的距离 （cm）;Mr=K*10-bm;lgMr=lgK - b*m=K1 - b*mMr为蛋白质的相对分子质量；K,K1为常数；b为斜率；m为迁移率。（以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得一条标准曲线。）试剂一一不连续体系有关试剂：【100g/L的SDS溶液。称取5gSDS,加双蒸水至50mL,微热使其溶解，置于试剂瓶内，于4摄氏度下储存。SDS在低温下易析出晶体，使用前应微热使其完全溶解；1% （体积分数）的 TEMED溶液。量取1mL TEMED，加双蒸水稀释至 1

7、00mL,置于棕色 瓶内，于4摄氏度下储存；100g/L的AP溶液。称取1g AP,加双蒸水溶解至10mL,最好临用前配制；样品溶解液（内含2%的SDS、5%的疏基乙醇、40%的蔗糖、0.02%的漠酚蓝的0.01mol/LpH 值为8.0的Tris-HCl缓冲液）。先配制0.05mol/LpH值为8.0的Tris-HCl缓冲液：称取0.6gTris, 加入50mL双蒸水，再加入约 3mL1mol/L的HCl溶液，调整pH值至8.0,最后用双蒸水定 容至100mL;样品溶解液的配置按表添加各组分:SDS疏基乙醇蔗糖漠酚蓝0.05mol/LTris-HCl缓冲液总体积200mg0.5mL4g2mg

8、2mL10mL凝胶储液。a.30%的分离胶储液：称取 30gAcr及0.8gBis,溶于双蒸水中，定容至 100mL,过 滤后置于棕色瓶内，于 4摄氏度下储存；b.10%的浓缩胶储液：称取 10gAcr及0.5gBis，溶于 双蒸水中，最后定容至 100mL,过滤后置于棕色瓶中，于 4摄氏度下储存；凝胶缓冲液。a.分离胶缓冲液（3.0mol/L pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液）：称取36.3gTris, 加少许双蒸水使其溶解，再加1mol/L的HCl溶液约48mL,调整pH至8.9,最后用双蒸水定容至100mL,于4摄氏度下储存；b.浓缩胶缓冲液（0.5 mol/LpH值为6.7的Tr

9、is-HCl缓冲液）: 称取6.0gTris，加少许双蒸水使其溶解，再加 1mol/L的HCl溶液约48mL ,调整pH至6.7, 最后用双蒸水定容至 100mL,于4摄氏度下储存；电极缓冲液（内含0.1%的SDS的pH值为8.3的Tris（0.05mol/L）-甘氨酸（0.384mol/L ）缓冲 液）。称取6.0gTris和28.8g甘氨酸，加入10mL 10%的SDS,再加蒸储水使其溶解，最后定 容至 1000mL;1%的琼脂（糖）溶液。称取1g琼脂（糖）于100mL电极缓冲液中，加热使其溶解，于 4 摄氏度下储存备用。】固定液。取454mL 50%的甲醇和46mL冰乙酸，混合均匀；染色液。称取0.125g考马斯亮蓝R250，加250mL上述固定液，过滤后备用； 脱色液。取75mL冰乙酸和50m