补阳还五汤中总黄酮提取工艺探究

1、补阳还五汤中总黄酮提取工艺探究【摘要】目的：通过正交设计用不同的因素及不同的水平 的提取方法来得到提取补阳还五汤中总黄酮的最佳工艺。方 法：用正交试验的方法从乙醇的浓度，提取时间，溶剂倍量, 提取次数四个不同因素，每个因素设置3个不同的水平。以 总黄酮含量为考察指标，从中寻找一个最合适的提取条件。 用紫外分光光度法测定总黄酮含量和纯度，从而确定总黄酮 提取的最佳工艺。结果：确定补阳还五汤中总黄酮的最佳工 艺条件为用70%的乙醇150ml煎煮3次，每次90mino结论: 此次试验以乙醇作为提取溶剂，廉价、安全，且符合工业化 生产的要求。【关键词】补阳还五汤；总黄酮；含量测定补阳还五汤是清代名医王

2、清任创制的经典复方，该方由 黄英120g、当归尾6g、赤芍5g、地龙、川苇、桃仁、红花 各3g组成，具有补气、活血、通络的功效，主治中风及其 后遗症，其中所含的黄英是重要的补气中药。本试验研究的 是补阳还五汤的提取液。它含有多糖、黄酮类和皂昔类等多 种有效成分1。本试验是恒温水浴提取补阳还五汤中总黄 酮的工艺研究，为补阳还五汤的进一步研究和开发提供资料 和依据，为补阳还五汤及其它经典复方的创新研究提供一定 的参考价值。运用现代化学方法研究传统中药，建立起中药 质量控制标准，研制出“安全、有效、可控、稳定”的新药。1实验材料1.1器材电子天平ag135型，恒温水浴锅，旋转蒸发仪，循环水 式真空泵

3、shz-d (iii)型，电热恒温鼓风干燥箱dgg-9140a 型,双光束紫外可见分光光度计tu-1900型，抽滤瓶等。1.2药品与试剂黄竄、当归、赤芍、地龙、川苇、桃仁红花由杭州方 回春堂药店提供。芦丁对照品，由浙江省食品药品检验所提 供。无水乙醇：99. 7%分析纯，安徽安特生物化学有限公司 生产。10%nan02 溶液，10%al (n03)3 溶液，lmol/1 的 naoh 溶液，浓氨水，1%三氯化铝。2实验方法2. 1补阳还五汤总黄酮的提取2精密称取补阳还五汤药材，加70%乙醇150ml,提取2次, 乙醇水浴回流提取90 min,过滤，摇匀，浓缩，挥干至浆状， 剩余物用60%乙醇溶

4、解置于50ml容量瓶中，加60%乙醇稀释 至刻度，摇匀，作供试品备用。2. 2黄酮含量测定2. 2. 1定性测定实验步骤32. 2. 1. 1紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上, 在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。2. 2. 1. 2浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上,将滤纸 在氨水上方熏15min ,立即在紫外光下观察(254nm)，呈极明 显的黄褐色荧光斑点。2.2. 1.3三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1 %三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外 光下呈黄色荧光斑点。2. 2. 2定量测定42. 2. 2. 1对照品溶液的制备精密称取在10

5、5°c干燥恒重的芦丁对照品20mg于100ml 容量瓶中，60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取 10ml置50ml容量瓶中，60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得 每 lml 含无水芦丁 0. 040mg (40ug/ml)2. 2. 2. 2最大吸收波长的确定5取供试品溶液lml放入100ml容量瓶中，加入10%nan02 溶液lml,5min后加入10%a1(n03)3溶液lml,摇匀,6min后 加入lmol/1的naoh溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度，用紫 外可见分光光度计将供试品溶液在400600nm处进行扫描, 结果发现对照品溶液及供试品溶液在510nm附近有最

6、大吸 收峰，实验中选择测定波长为510nmo2. 2. 2. 3标准曲线的绘制精密量取对照品溶液2,3,4,5,6,7ml,分别置25ml容量 瓶中加入10%nan02溶液lml,5min后加入10%al(n03)3溶液 lml,摇匀，6min后加入lmol/1的naoh溶液5ml,用60%乙醇 稀释至刻度，摇匀，制成含芦丁 3. 211.2ug/ml的系列标准 溶液。(以25ml容量瓶中加入10%nan02溶液lml,5min后加 入 10%al(n03)3 溶液 lml,摇匀，6min 后加入 lmol/1 的 naoh 溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度，摇匀作为空白)，在510 nm

7、波长处测定其吸光度。结果表明，芦丁在3. 211. 2 u g/ml范围内符合beer 定律，吸光度与浓度呈良好的线性关系，其回归方程 为:y=0. 0239x-0. 01,相关系数 r二0.9991。2. 2. 2. 4精密度试验从对照品溶液中，量取2ml放入25ml容量瓶中，加入 10%nan02 溶液 lml,5min 后加入 10%al(n03)3 溶液 1ml,摇 匀,6min后加入lmol/1的naoh溶液5ml,用60%乙醇稀释至 刻度，摇匀。溶液1ml,摇匀,6min后加入lmol/1的naoh溶 液5ml,用60%乙醇稀释至刻度，摇匀作为空白)测在510nm 波长处测定其吸光

8、度，重复六次。结果见表精密试验结果：结果表明，rsd%乙醇浓度为70%,60min /次，溶剂量为150ml来提取, 提取次数分别为1次，2次，3次，4次。再测定各水平总 黄酮的吸光度为0. 123, 0. 145, 0. 150, 0. 143,得提取3次 最好。2. 3. 2验证性实验取补阳还伍汤药材按最佳工艺条件进行提取，进行验证 实验结果见表。3讨论试验结果亦表明总黄酮的提取工艺与乙醇浓度及溶剂 倍量有显著关系，所以最终确定补阳还五汤中总黄酮的提取 工艺条件为a2b1c3d2,确定补阳还五汤中总黄酮的最佳工艺 条件为用70%的乙醇150ml煎煮3次，每次90mino且试验 证明其精密度

9、和稳定性良好。用铝盐分光光度法测定黄酮的 含量，结果准确可靠，操作简单易行，此法的关键是显色时间 要把握好，一般以llmin为宜。所得总黄酮是深棕色物质， 为方便以后的含量测定，用60%的乙醇定容。初步测得补阳 还五汤中总黄酮的含量为41. 402mg/ml。提取时间的长短和 恒温水浴温度的控制，实质上是体现在温度对浸提效果的影 响，一方面浸提速度宜接与浸提温度成正相关，另一方面温 度升高，溶剂的粘度减少，也增大了浸提温度效率。但是， 鉴于有效成分的热稳定性，以及温度升高时杂质溶出量也相 应增大，在提取时浸提温度不能过高，同时也考虑到乙醇的 沸点是78. 5°c,温度过高，乙醇挥发严

10、重，生产成本增大。因此将恒温水浴锅温度控制在80°c-85°c之间。本试验以廉 价、安全的乙醇作为提取溶剂，所得样品有效成分含量高, 表明该方法简便、实用、经济。为补阳还五汤的进一步研究 和开发提供资料和依据，为补阳还五汤及其它经典复方的创 新研究提供一定的参考价值。参考文献1 .王晩霞，李荣亨，补阳还五汤作用机制研究进展j. 中西医结合心脑血管病杂志,2008,6 (5)： 574576。2 .纪松岗，李翔，正交设计法确定黄英中黄酮类成分 的超声提取条件第二军医大学学报，2005,26(10):1168-1170o3 .范媛媛，李新华，绿豆黄酮提取工艺研究j.沈阳 农业大学学报，2005, 36(5)： 619- 622。4 .蔡碧琼，余萍，水稻谷壳中总黄酮提取工艺及其性 质表征江西农业大学学报,2007, 36(5)： 142-147o5 .蔡凌云，肖娟，白叶中黄酮成分的鉴定和含量测 定绵阳师范学院学