腹腔镜检查与rtｐcr在胃癌诊疗中的临床意义

1、腹腔镜检查与rtpcr在胃癌诊疗中的临床意义作者：张茂修，张光永，汪运山，孙善会，刘杨【摘要】目的：探讨进展期胃癌术前腹腔镜检查与rtpcr检测腹腔灌洗液中游 离癌细胞ceamrna的表达水平，在胃癌患者术后微转移及预后的临床駛。方法: 对52例进展期胃癌患者术前行腹腔镜探查，灭菌生理盐水冲洗腹腔4一5次，收 集脱落细胞，进行细胞学检查和rtpcr检测c e amrna表达水平。结果：52例 胃癌患者中，细胞形态学检测326 % ( 1 7 /52)阳性，rtp cr检测5 5 8 % ( 29/52) c e amrna阳性表达，二者阳性率有显著性差异(p< 005 )o结论： 诊断性

2、腹腔镜检查、rtpcr与plc有效结合，可提高腹腔转移复发诊断的 灵敏性和特异性，有助于对胃癌分期、淋巴转移和预后的综合判断，对胃癌的辅 助治疗提供依据。【关键词】腹腔镜；胃癌；游离癌细胞；rtpcrthe clinical significance of laparoscopy chol and rtpcr in gastric carcinoma diagnosis and therapyabstract 0bject ive:to evaluate ceamrna expression of peritoneal lavage fluid (plf)of patients wi th p

3、rogressive gastric cancer by laparoscopy and rtpcr before operation, we assess peritoneal metastasis09%ns about 4 5 times,and collected peritoneal free cells cytology and rt-pcrresults: the overall positive rate of 326%( 17/52), rtpcr positive rate was 558%(29/52); the rate of significantly higher t

4、han cytology findings (p &it;and prognosis after operation methods: before operation, we handled 52 patients with progressive gastric cancer by laparoscopy, washing abdominal cavity with detected by cytology was rtpcr was 005)conclusions: the efficient association of diagnostic lc、rtpcr and plc

5、(peritoneal lavage cytology)can help improving diagnostic specialty and sensitivity of peritoneal metastasis, synthetically analyzing the relation of stage classification, lymphnode metastasis and prognosis, in order to provide information for further adjuvant therapykey words laparoscopy; gastric c

6、arci no ma; free can cer cel is; rtpcr胃癌在我国的患病率和死亡率均居恶性肿瘤前列，手术是最有效的治疗方法, 但半数以上的患者术后复发转移，从而导致手术失败。国内外学者研究发现腹腔 游离癌细胞("ee cancer cells, fcc )在腹腔内形成肉眼或h e染色均不能发 现的微转移灶是胃癌复发的重要原因。nakanishi等1 提出侵及浆膜层的肿 瘤细胞易于脱落的原因与肿瘤细胞缺乏cd44和|3 intergin粘附分子表达有关，ifccs在腹腔细胞刺激因子作用下，生物活性增高，侵及腹膜下组织形成微小转 移灶，致术后转移扩散。本研究首次运用腹

7、腔镜的微创伤性、rt pcr的特异性 和灵敏性检测腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid, plf )中游离癌细胞及其 c e amrna表达水平，明确胃癌腹腔转移形成机制，为胃癌的临床诊疗提供依据。1材料与方法11试剂与设备rtpcr试剂、琼脂糖、dna marker. depc水、taq酶购自上海生工；c e a ( pl5 ' gagcgaacctcaacctctcctgccact-3 ' p2 5'tgtagctgttgcaaatgctttaaggaagaagc 3 ' , 367bp)引物由上海博亚合成；t r i zol 试剂购自

8、invitrogin公司；腹腔镜、离心机、5700pcr扩增仪、超低温冰箱、电 泳仪、凝胶成像系统。12方法12 1细胞的收集2000年3月至2003年12月山东大学第二医院行腹腔镜探查的进展期胃癌患 者5 2例，男42例平均(5 6 5 ±62)岁，女10例，平均(60±56)岁，在腹腔 镜手术对肿瘤组织进行侵入性操作前行腹腔灌洗，用42、300ml灭菌生理盐水 冲洗胃床、腹腔等处，尽可能吸取冲洗液，加入edt a抗凝剂，3 0 0 0转/ 分离心lomin,弃上清，部分脱落细胞固定he染色，由2位细胞学医师盲法随 机阅片，做出诊断。另部分沉淀脱落细胞迅速置于超低温冰箱用

9、于mrna提取。12 2 总rna提取trizol体系提取总rna。提取的rna用01%depc水溶解，紫外分光光度仪 检测rn a样品的od 260nm/od280mn比值，得到rna浓度，然后置于-80°c保存 或立即检测。123 r t p c rlug 总 rna、lul mmlv、7ul 逆转录反应体系、lul antisense primer pl、 去rnase水补至20ul,快速离心混匀，37°clh, 95°c10min灭活mmlv,快速离心 使沉于底部。124 pcr反应19ul pcr反应体系、lul sense primer p2、58ul

10、超净水,快速离心混匀, 快速离心均匀，95°c5min,快速离心,使沉于管底，加入2ul ( lu/ul ) taqdna 聚合酶，快速离心均匀，加入100ul液体石蜡。循环条件:94c lmin、58°c lmin、 72°clmin,循环35次,末次延长7min0 pcr扩增产物2%琼脂糖(含eb05mg/l)dna电泳。2结果52例各期进展期胃癌患者中，经腹腔镜plc he染色细胞形态学检测游离癌 细胞 326% (17/52)阳性;rtp c r检测 55 8 % ( 29 / 52 ) ceamrna 阳性表达。 x 2检验两者检测阳性率存在显著性差异(

11、pc 0025 )。3 讨论p l c检查是一个有用的预测预后的因素，由于该法是检测plf中fccs,故 敏感性较差。应用plc检测胃癌fccs的阳性率各家报道不一，诊断腹腔转移的 特异性也存在差别，一般认为fccs检出率与胃癌浆膜浸润的程度有关。abe 等2 在77个常规plc检查阴性的胃癌中，14个(22% )出现腹腔复发，在 1 7个常规plc检查阳性胃癌中，只有3个(18% )出现腹腔复发，故认为常规 plc检查并不是一个预测腹腔复发的敏感指标，其估计预后的价值也是有限的。 tokuda等3 应用常规plc在136例胃癌患者中仅发现fccs阳性率为36%。plc或plc结合p l f中

12、肿瘤标志物是预测胃癌腹腔复发的有效指标，但是, 对plf中仅有的少量fccs而言无能为力，就需采用新的方法加以确认，因为 上述实验结果阴性患者仍有部分出现腹腔转移复发。yonemura等4 应用r t pcr技术测定了 p l f中mmp 7mrna表达,结果可检测到样品中10个以下癌细 胞，而在间皮细胞、成纤维细胞、外周血和胃良性病变患者腹腔灌洗液中均未检 测到mmp7mrna信号。该法预测腹腔肿瘤播散的敏感性为33%,结合plc检查可 达62%。本组实验检测的各期进展期胃癌患者中，经腹腔镜plc he染色细胞形 态学检测游离癌细胞326 % (17/52)阳性；rtpcr检测558 % (

13、 2 9 /52 ) c e amrna阳性表达，与国外报道基本一致。fujii等5 应用rt pcr和plc检查了 86例胃癌plf中fccs,结果13个肉眼可见腹腔转移的患者c e amrna 均阳性，而24个无浆膜浸润的患者cea均阴性。在49个肉眼可见浆膜浸润但无 腹腔转移的患者中，常规pl c阳性率仅为12%,而rtpcr ceamrna阳性率达 55%,在cea阳性患者中，术后12个月内腹腔复发转移率为5 6 %, yonemura 等4 对230个胃癌plf中ceamrna的研究结果表明，plf中rtpcr ceamrna、 plc和el i sa法测定的cea水平的阳性率分别为

14、17%、19%和15%。plc 与淋巴结状态、浸润深度和静脉浸润有关，rtpcr c ea仅与腹腔复发相关，而 p l f中cea水平与腹腔复发无相关性。ceart p cr预测腹腔复发的敏感性和特 异性分别为31 %和9 5 %,准确性达73%。结合plc检查诊断腹腔复发的敏感性 可达57%。sakakura等6 应用cea特异的rtpcr检测了大网膜乳头的胃癌微转移， 结果发现对于判别胃癌腹腔复发，检测大网膜乳头优于plf。ueno等7和 kodera等8 应用定量rtpcr检测了胃癌plf和大网膜中的ceamrna表达水平, 结果应用ceamrna诊断plf中fccs的敏感性和特异性分别

15、为77%和9 4 %,大网 膜中的敏感性和特异性分别为46%和90%。多因素分析显示plf中ceamrna表达 水平是唯一危险因子，因此认为p l f中ceamrna表达水平可以敏感地预测胃 癌患者的腹腔复发，并与淋巴结转移和浆膜浸润有关，而p lc则不存在这种相 关性。tokuda等3 同法测定了 136例胃癌plf中ceamrna表达水平，结果发 现该法的敏感性(221% )明显高于细胞学检查(36% ), ceamrna阳性患者的腹 腔复发率明显高于阴性患者(p< 00001 )o rtpcr的阳性率随淋巴结转移，淋巴 管浸润、肿瘤浸润深度和临床分级的增加而提高。在plc阴性患者中

16、，cea阳 性患者的生存期明显低于cea阴性患者(pv 0000 1 )。ribeiro等9 对49例进展期胃癌患者进行了术前腹腔镜检查，结果发 现只有163%患者存在腹腔转移，而应用p l c检查则发现41%患者存在卩：$。 在术中无肉眼可见的腹腔转移患者中，29%患者存在ifccs,且ifccs只存在浆 膜浸润3cm2或附近器官和结构被浸润的病例。结果提示，术前腹腔镜检查腹 腔转移的效果是有限的，应借助于腹腔镜检查的优势同时进行plc等检查方能提 高诊断ifccs的敏感性和特异性。plc已经作为常规技术用于ifccs检查，对仅有少量fccs的plf尚不能做出 阳性诊断，故其敏感性较差。因此

17、，应用分子生物学方法rtpcr检测fccs成为 研究热点，尽管这些方法目前仍处于临床研究阶段,但已经显示出良好的应用前 景。如果将快速的rtpcr技术、plc检查与诊断性腹腔镜检查有效地结合使用， 不但能提高腹腔转移复发诊断的敏感性和特异性，而且有助于对胃癌分期、淋巴 转移和预后的综合判断，对胃癌的治疗也有重要的指导意义。参考文献：1 nakanish;h,kodera y, toari i a, et a 1detect ion of carcinoembryonic antigenexpressing free tumor cells in peritoneal washes from p

18、atients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction j jpn j cancer res,1997,88:687-6922 abe s, yoshimura h, tabara h, et alcurative resection of gastric cancer: limitation of peritoneal lavage cytology in predicting the outcome j j surg oncol, 1995, 59 (4): 226-229.3 tokuda k,natsugoe s, nak

19、ajo a, et alclinical significance of ceamrna expression in peritoneal lavage fluid from patients with gastric cancer j int j mol med,2003,11 (1): 79-844 yonemura y, endou y,fujimura t, et aldiagnostic value of preoperative rtpcrbased screening method to detect carci noembryonic antigenexpressing fre

20、e cancer cells in the peritoneal cavity from patients with gastric cancer j anz j surg,2001,71 (9):521-5285 fuj i i s, kitayama j, kaisaki s, et alcarcinoembryonic antigen mrna in abdominal cavity as a useful predictor of peritoneal recurrence of gastric cancer with serosal exposure j j exp clin cancer res,2002,21 (4):547-5536 sakakura c, hagiwara a, shirasu m, et al polymerase chain react ion for detection of carcinoembryonic antigenexpressing tumor cells on milky spots of the greater omentum in gastric cancer patients: a pi lot study j int j cancer, 2001, 95 (5): 286-289.7 ueno h,