DNA重组的载体学习教案

1、会计学1DNA重组的载体重组的载体 第1页/共62页 一质粒载体一质粒载体 (Plasmid) 1质粒的基本特性质粒的基本特性 1）自主复制性。）自主复制性。 具有自己的复制起始位点具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和和 控制复制频率的控制复制频率的 控制基因控制基因 及编码基因，及编码基因， 形成形成 独立复制子独立复制子 (Replico) 结构。结构。第2页/共62页 2）可扩增性。）可扩增性。 严紧型复制质粒严紧型复制质粒 (Stringent) 由宿主细胞内聚合酶由宿主细胞内聚合酶III介导，介导， 为质粒上编码的蛋白因子正调控，蛋白因子极不稳定，为质粒上编码的蛋

2、白因子正调控，蛋白因子极不稳定， 每个细胞复制每个细胞复制1-5个质粒拷贝。个质粒拷贝。 松弛型复制质粒松弛型复制质粒 ( Relaxed) 质粒复制需要半衰期长的聚合酶质粒复制需要半衰期长的聚合酶I；聚合酶，；聚合酶， 以及辅助的蛋白因子参与，合成减弱或完全中断时，以及辅助的蛋白因子参与，合成减弱或完全中断时， 质粒复制持续进行，具有高拷贝数质粒复制持续进行，具有高拷贝数30-50个。个。第3页/共62页 当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成，阻断宿主菌代谢途，当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成，阻断宿主菌代谢途， 而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制，而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制

3、， 每个细胞积累上千个每个细胞积累上千个DNA分子。分子。 这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白因子相互作用。这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白因子相互作用。 3) 可转移性可转移性 在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用 从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。第4页/共62页 4） 不相容性不相容性 相同相同 或或 相似相似 复制子结构及特征的两种不同质粒复制子结构及特征的两种不同质粒 不能稳定地存在于同一受体细胞内，不能稳定地存在于同一受体细胞内， 这种现象称质粒的不相容性。这种现象称质粒的不相容性。 a) 两种不同质粒

4、同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机. b) 分裂前夕的拷贝数不均等，分裂前夕的拷贝数不均等， 经过若干次细胞分裂后必然导致，经过若干次细胞分裂后必然导致， 两种不同质粒的独占性。两种不同质粒的独占性。 选择标记的插入失活选择标记的插入失活第5页/共62页插入失活插入失活第6页/共62页 2质粒的改造与构建质粒的改造与构建1）删除不必要的）删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源区域，缩小分子量，提高外源DNA片段片段 装载量。装载量。2）灭活某些质粒的编码基因。）灭活某些质粒的编码基因。3）加入易于识别的选择标记基因。）加入易于识别

5、的选择标记基因。 4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列- 多克隆接头多克隆接头. (Polylinker)5） 加加 入特殊的基因表达调控元件。入特殊的基因表达调控元件。 载体的质粒构建过程载体的质粒构建过程 图图3-1，图，图3-2第7页/共62页第8页/共62页第9页/共62页 金属硫蛋白突变体基因金属硫蛋白突变体基因 -在蓝藻中克隆在蓝藻中克隆 一简介一简介1- 小鼠金属硫蛋白突变体小鼠金属硫蛋白突变体 结构域结构域 二聚体二聚体-， 对重金对重金 属有强结合能力。属有强结合能力。2PpSbA 强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝

6、藻中强启动功能强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻中强启动功能3pRL- 中间载体，突变体与强启动子相连中间载体，突变体与强启动子相连.4PDC- 穿梭表达载体，穿梭表达载体， 5PCC7120 鱼星藻鱼星藻 目的：目的： 构建穿梭表达载体，含有强启动子，构建穿梭表达载体，含有强启动子， 金属硫蛋白突变体基因，在蓝藻中表达。金属硫蛋白突变体基因，在蓝藻中表达。表明：表明： 转基因藻具有吸附金属的能力。转基因藻具有吸附金属的能力。 第10页/共62页第11页/共62页 穿梭表达载体的构建穿梭表达载体的构建 1 人工合成两引物，人工合成两引物，5-GA GAATT CATTCATGTGCTGCTCC

7、TGCTGCTGT-3 BamH l 5-CT GGATC CTCAGGCACAGCAAGTGCAiGCA-3 E.coR1 与与 PG2A 进行进行 PCR，得到突变体基因，两端含有，得到突变体基因，两端含有 E.coR 1 和和 BamH 1 双酶切位点。双酶切位点。第12页/共62页2. RL-439 中间质粒。被中间质粒。被 E.COR I 和和 BamH I 双酶切双酶切.3.(12)两者两者 T4-连接酶连接酶 连接，连接， -基因基因 定向克隆到定向克隆到 强动强动 子子 PpSbA 之后之后.4. PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻强启动功能强启动子，在叶绿体，大肠杆

8、菌，蓝藻强启动功能5. 穿梭表达载体的获得穿梭表达载体的获得1) 中间载体中间载体 PRI-, 穿梭表达载体穿梭表达载体 pDC-08 用用EcoRI 酶切酶切2) T4-DNasa 相连相连,3) 用用 EcoRI 酶切载体酶切载体, 鉴定。鉴定。 第13页/共62页6. 三亲结合转移与筛选，三亲结合转移与筛选，7. 转化子鉴定。转化子鉴定。8. 蛋白质印迹鉴定蛋白质印迹鉴定.第14页/共62页第15页/共62页第16页/共62页第17页/共62页第18页/共62页第19页/共62页 图1 愈伤组织小块接种于不同比例的激素中，待分化。第20页/共62页 图2 愈伤组织已长成。 第21页/共6

9、2页第22页/共62页3质粒的分类及用途质粒的分类及用途 1）克隆质粒：）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。用于克隆和扩增外源基因。 2） 测序质粒：测序质粒： a) 高拷贝复制，便于高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。片段克隆和扩增。 b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域， 设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。 3） 整合质粒：整合质粒： 含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合 质粒上的外源基因进入受体细胞后

10、，准确重组整合在质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在 染色体染色体 的特定位置上。的特定位置上。 第23页/共62页 4）穿梭质粒）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及 相应选择标记基因，相应选择标记基因， 因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。 大肠杆菌大肠杆菌-链酶素穿梭质粒，大肠杆菌链酶素穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。酵母菌穿梭质粒。 b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体 直接从一个受体菌转移至直接从一个受体菌转移至 另一个受

11、体菌中复制并遗传。另一个受体菌中复制并遗传。 第24页/共62页5）探针质粒）探针质粒 a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，设计用来筛选克隆基因的表达调控元件， 如启动子，终止子。如启动子，终止子。 b) 装有定量检测表达程度的报告基因，装有定量检测表达程度的报告基因， （抗生素的抗性基因）（抗生素的抗性基因） c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因 d) 当含有启动子，终止子的当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，片段插入合适的位点， 报告基因才能表达。报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应表达量的大小直接反应

12、被克隆基因的表达调控元件的强弱。被克隆基因的表达调控元件的强弱。第25页/共62页6）表达质粒）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的 启动启动 子，合适的核糖体结合位点（子，合适的核糖体结合位点（SD 序列），序列）， 终止子结构。终止子结构。 使得克隆在合适位点上的任何外源基因使得克隆在合适位点上的任何外源基因 都可在受体细胞中都可在受体细胞中,高效表达。高效表达。 b)大肠杆菌常用启动子：大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp,和来自噬菌体和来自噬菌体 强启动子强启动子 PL, PR 。 它们它们 由大

13、肠杆菌由大肠杆菌 RNA 聚合酶聚合酶 识别识别 起始起始. 第26页/共62页c)来自来自 T7 噬菌体的噬菌体的 T7 启动子。启动子。 必须由必须由 T7 噬菌体来源噬菌体来源 T7 RNA聚合酶聚合酶 识别识别 起始转录。起始转录。 d) 表达载体用表达载体用 T7 启动子必须用能产生启动子必须用能产生 T7 RNA 聚合酶的聚合酶的 受体菌株受体菌株 JM109 , BL21(DE3)。e) PSPORT 系列和系列和 pSP 系列。系列。第27页/共62页4. 实验室常用大肠杆菌载体实验室常用大肠杆菌载体 质粒质粒 大小大小(Kb) 选择标记选择标记 克隆位点克隆位点 功能功能pB

14、R322 4.36 Ap,Tc BamHI,PstI,EcoRI 克隆载体克隆载体 pGEX 4.9 Ap,Lac PstI,MluI, EcoRV 次级克隆载次级克隆载体体 Ap,Iac, NarV 酶解作标准分子量酶解作标准分子量 pKK233-2 4.6 Ap,Tc SalI, BamHI, 表达型表达型NcoI位点提位点提供供 PstI, NcoI ,EcoRI 翻译启始密码子翻译启始密码子 pSP72 2.6 Ap XhoI, PstI, BamHI 表达型表达型,携有携有 - HidIII EcoRV 双向双向T7,Sp6启动子启动子 pSPORT1 4.11 Ap, Lacopz

15、 EcoRI ,SalI, Pst 表达型携有表达型携有 BamHI ,HidIII 双向双向T7,Sp6启动子启动子 pUC18/19 2.69 Ap,Lacz EcoRI, HidIII 测序载体测序载体, KpnI ,BamHI 次级克隆载体次级克隆载体 第28页/共62页5. 质粒的纯化质粒的纯化 1. 碱裂解法碱裂解法 a) 溶菌酶溶菌酶 破细胞壁；破细胞壁； b) SDS-NaOH 混合液混合液 去细胞膜，释放细胞内含物去细胞膜，释放细胞内含物 ； c) 高浓度高浓度 醋酸钾醋酸钾 沉淀染色体，去除染色体沉淀染色体，去除染色体 DNA和和 蛋白质；蛋白质； d) 苯酚苯酚-氯仿灭活

16、核酸酶，去除蛋白质；氯仿灭活核酸酶，去除蛋白质； e) 乙醇沉淀水相质粒；乙醇沉淀水相质粒； f ) 用用 Rnase 降解降解 RNA。 优点：质粒纯净优点：质粒纯净 。 缺点：存在一定比例开环结构缺点：存在一定比例开环结构。第29页/共62页2. 沸水法沸水法a) 用牙签挑取固体培养基的菌体，用牙签挑取固体培养基的菌体，b) 悬浮在悬浮在 EDTA, Triton-100, 溶菌酶缓冲液溶菌酶缓冲液 ，c) 沸水中沸水中 30-40s ，d) 离心，挑去沉淀物离心，挑去沉淀物 ，e) 乙醇沉淀水相乙醇沉淀水相 质粒质粒 DNA。 优点：速度快优点：速度快200个克隆个克隆/每天每天 ， 缺

17、点：纯度不高。缺点：纯度不高。3. 由于空间结构不同，电泳条件下迁移率顺序由于空间结构不同，电泳条件下迁移率顺序: cccDNA L-DNA OC-DNA D-DNA T-DNA 经限制性内切酶处理，所有结构都为直线性分子。经限制性内切酶处理，所有结构都为直线性分子。第30页/共62页电泳方向电泳方向 V | T-DNA - | D-DNA - | OC-DNA -V L-DNA - - Ccc-DNA - 对照对照 酶切酶切 质粒质粒 DNA 酶切图谱示意酶切图谱示意第31页/共62页 图 2-4 DNA 酶解后的电泳图谱 1 2 3 4 5 6 7第32页/共62页3. 氯化铯密度梯度离心

18、法氯化铯密度梯度离心法 氯化铯氯化铯 EtBr（溴化乙啶）（溴化乙啶） a) 细菌裂解及分离过程中染色体易断裂为线性分子细菌裂解及分离过程中染色体易断裂为线性分子 b)质粒质粒DNA分子量小，结构紧密，保持环状。分子量小，结构紧密，保持环状。 c) 溴化乙啶插入溴化乙啶插入 线性线性 DNA 多，密度低。多，密度低。 石蜡油层石蜡油层 蛋白质蛋白质 缺口环状和线性缺口环状和线性DNA 闭环质粒闭环质粒DNA RNA 第33页/共62页二入二入-双链双链 噬菌体噬菌体 入入- 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：1.是大肠杆菌温和型是大肠杆菌温和型 噬菌体，噬菌体， 由头部外壳蛋白和由头部外壳蛋

19、白和 48.5 kb 双链双链DNA 组成，组成， 入入- DNA两端各有一个两端各有一个12 碱基碱基 组成互补单链组成互补单链,称称cos末端，末端，cos 末端将末端将 DNA 引入头部结构。引入头部结构。2.大肠杆菌大肠杆菌 宿主细胞裂解释放宿主细胞裂解释放 噬菌体颗粒，噬菌体颗粒， 噬菌体噬菌体 颗粒又感染附近大肠杆菌颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，形成新一轮裂解周期， 入入- 噬菌体噬菌体 悬浮液加到大悬浮液加到大 肠杆菌液体培养基，肠杆菌液体培养基， 37C 培养培养 6小时，培养液由小时，培养液由 混浊变混浊变 澄清，澄清， 说明大肠杆菌完全被裂解。说明大肠杆菌完全

20、被裂解。第34页/共62页3.噬菌斑噬菌斑 A. 入入- 噬菌体噬菌体 悬浮液悬浮液 加到加到 大肠杆菌，大肠杆菌， 和琼脂糖和琼脂糖 固体固体 培养基，培养基， 37C 过夜。过夜。 B. 固体平板培养基固体平板培养基 出现出现 透明斑点（噬菌斑）透明斑点（噬菌斑）. 噬菌斑是噬菌斑是 经过若干裂解周期经过若干裂解周期 形成形成 宿主菌死亡区域。宿主菌死亡区域。 同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌 仍能生长仍能生长.4.一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒， 均由一个噬菌体无性繁殖所产生的，均由一个噬菌体无性繁殖所产生的， 是入

21、是入- 噬菌体噬菌体 DNA 用于分子克隆的基本原理。用于分子克隆的基本原理。第35页/共62页三入三入-双链双链 噬菌体噬菌体 载体载体 a)入入-DNA 通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞 或受体或受体 细胞，细胞，b) 入入-DNA在大肠杆菌中高拷贝复制，在大肠杆菌中高拷贝复制，c) 噬菌体的头部空壳蛋白对噬菌体的头部空壳蛋白对 入入DNA 的包装与其序列无关的包装与其序列无关,只只 识别识别COS位点。位点。d) 在分子克隆早期就被选作载体使用。在分子克隆早期就被选作载体使用。第36页/共62页第37页/共62页1重组体分子的体外包装重组体分子的体

22、外包装1）把带有目的基因的外源片段插入载体，）把带有目的基因的外源片段插入载体， 导入寄主细胞。直接感染大肠杆菌，导入寄主细胞。直接感染大肠杆菌， 转染转染 （transfection） 形成形成 噬菌斑。噬菌斑。2）体外包装，把重组体分子包装为）体外包装，把重组体分子包装为 成熟的噬菌体颗粒，成熟的噬菌体颗粒， 再导入寄主细胞。再导入寄主细胞。第38页/共62页3）入）入-DNA 包装包装 入入-噬菌体噬菌体 头部前体结构头部前体结构 a) 头部空壳蛋白可包装最大限度头部空壳蛋白可包装最大限度 51 Kb, 大于大于 51 Kb 头部包装头部包装 不进去，不进去， 最小限度最小限度 38 K

23、b， 小于小于 38 Kb 噬菌体颗粒无侵染性。噬菌体颗粒无侵染性。 包装限度是包装限度是 入入-DNA 总长的总长的 75%-105% (38 Kb，51 Kb) b) 野生野生型野生野生型 入入DNA 长度为长度为 48 Kb， 其中其中 40%， 约约20 Kb 对对 整合，切割极其重要。整合，切割极其重要。 c) 野生型野生型 入入DNA 基因组中基因组中 编码必要基因的编码必要基因的 DNA 区段约区段约 占占20 Kb. d) 带目的基因的外源片段带目的基因的外源片段 入入DNA 载体极限约载体极限约 23 Kb.第39页/共62页2野生型野生型 入入DNA 载体的构建载体的构建

24、1） 缩短长度，提高外源缩短长度，提高外源 DNA 片段的片段的 有效装载。有效装载。 入入DNA 中部重组整合区占中部重组整合区占 入入DNA 的的 40% （ 19.4 Kb），）， 缺失不影响缺失不影响 入入DNA 复制与裂解周期，可重组改造。复制与裂解周期，可重组改造。 改造后带目的基因的外源片段改造后带目的基因的外源片段 入入DNA 载体极限载体极限 23 Kb2）删除重复的酶切位点。）删除重复的酶切位点。a) 野生型野生型 入入DNA 有重复酶切位点，有重复酶切位点，5个个EcoRI，7个个HidIII.b) 引入多酶切口接头。引入多酶切口接头。第40页/共62页3）灭活与裂解周期

25、有关基因。）灭活与裂解周期有关基因。a) 野生型野生型 入入DNA 经改造后在所有大肠杆菌内进行繁殖，经改造后在所有大肠杆菌内进行繁殖， 极易扩散传播，重组体分子的性质，极易扩散传播，重组体分子的性质， 对生物体或人才类带来危害。对生物体或人才类带来危害。 b)将无义突变引入裂解周期有关基因内，将无义突变引入裂解周期有关基因内， 这种这种 入入DNA在的少数在的少数 大肠杆菌菌株中繁殖（大肠杆菌菌株中繁殖（K12） c)大肠杆菌大肠杆菌 K12 在蛋白质合成时在蛋白质合成时 纠正无义突变。纠正无义突变。 第41页/共62页4）引入）引入 选择标记选择标记 基因。基因。 LacZ，（基因片段来自

26、大肠杆菌），（基因片段来自大肠杆菌） a) 蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑 入入DNA载体编码载体编码 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端前端前146个氨基酸与个氨基酸与 大肠杆菌宿主大肠杆菌宿主 表达的表达的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 C 端端 肽段互补肽段互补 （-互补）形成全酶，互补）形成全酶， 酶将酶将5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D -半乳糖苷（半乳糖苷（X-gal)降解降解, 成为蓝色产物成为蓝色产物, 淡蓝色噬菌斑。淡蓝色噬菌斑。 b) 无色噬菌斑无色噬菌斑 重组外源基因插入后将酶灭活，重组外源基因插入后将酶灭活， 重组噬菌体形成无色噬菌斑。重组噬菌体形成无色噬菌斑。第42页/共62页第43页/

27、共62页 CI+标记基因，标记基因， 溶源状态，混浊噬菌斑溶源状态，混浊噬菌斑透明（重组）。透明（重组）。 CI+ 基因编码基因编码 CI 阻遏蛋白，阻遏蛋白， CI 基因突变的入基因突变的入-噬菌体形成透明噬菌体形成透明 噬菌斑。噬菌斑。 a. 入入DNA 载体携带含有载体携带含有 EcoRI 切点的切点的 CI+ 标记基因，标记基因， b. 这种载体进入高频溶源化突变的大肠杆菌内，建立溶源这种载体进入高频溶源化突变的大肠杆菌内，建立溶源 状态，形成混浊噬菌斑状态，形成混浊噬菌斑,(溶源细胞比未感染的细胞生长慢）溶源细胞比未感染的细胞生长慢） c. 当外源基因插入到当外源基因插入到 CI+标

28、记基因标记基因 EcoRI位点时，位点时， 导致导致CI+ 基基 因灭活，重组噬菌体，因不能建立溶源状态而因灭活，重组噬菌体，因不能建立溶源状态而 形成形成 透明噬菌斑。透明噬菌斑。第44页/共62页 Spi+ (P2干扰敏感性干扰敏感性 )，1. 野生型野生型 入入 噬菌体噬菌体 在在 P2 噬菌体溶源化的大肠杆菌中噬菌体溶源化的大肠杆菌中 不能进入裂解周期，称干扰敏感性。（不形成噬菌斑）不能进入裂解周期，称干扰敏感性。（不形成噬菌斑）2.但缺失重组基因但缺失重组基因 red, gam 的入的入 噬菌体噬菌体 在在P2 噬菌体溶源化噬菌体溶源化 的大肠杆菌将不受影响，裂解溶源菌正常繁殖的大肠

29、杆菌将不受影响，裂解溶源菌正常繁殖 而形成噬菌斑。而形成噬菌斑。3. 外源重组基因插入与载体某一片段缺失同时发生缺失片段含有外源重组基因插入与载体某一片段缺失同时发生缺失片段含有red, gam基因基因. （即（即red, gam基因缺失）基因缺失）4.凡是重组凡是重组 入入 噬菌体噬菌体 呈现呈现 Spi 表型表型 即裂解溶源菌即裂解溶源菌 形成噬菌斑形成噬菌斑第45页/共62页第46页/共62页2入入DNA 分类分类 及及 用途用途 a) 插入型载体：插入型载体： 改造后改造后 入入DNA 载体长度正好为包装下限，称插入型载体。载体长度正好为包装下限，称插入型载体。 允许允许 外源外源DN

30、A 插入片段插入片段 0-14.5Kb。 b) 取代型载体取代型载体: 入入DNA 长度长度 40Kb， 在非必需区含两个相同酶切口，之间距离在非必需区含两个相同酶切口，之间距离 14Kb， 去除这去除这 14Kb 用外源用外源DNA片段取而代之。片段取而代之。 1) Charon 系列系列 设计克隆外源设计克隆外源 DNA 大片段的大片段的 取代型载体取代型载体 第47页/共62页2) EMBL 系列系列 设计克隆外源设计克隆外源 DNA大片段大片段 的的 取代型载体。取代型载体。 优点：便于将外源优点：便于将外源DNA片段从重组体分子上切下。片段从重组体分子上切下。3) 入入-DASH 系

31、列系列 含有含有 方向互为相反方向互为相反 的两套多的两套多 克隆位点接头序列，克隆位点接头序列， 优点优点: 便于多种便于多种 外源外源 DNA大片段的大片段的 取代重组。取代重组。4) 入入-gt 系列系列 插入型表达插入型表达 载体可用来克隆表达外源载体可用来克隆表达外源 c-DNA， 优点优点: 载体上温度敏感型阻遏物载体上温度敏感型阻遏物, 用来控制复制用来控制复制 及融合蛋白的表达。及融合蛋白的表达。第48页/共62页3入入DNA 的纯化的纯化1) 含有含有 乳糖和乳糖和 MgCI 的的 LB 培养基上培养培养基上培养 大肠杆菌，大肠杆菌， 至至 对数生长期。对数生长期。 2) 加

32、入合适滴度加入合适滴度 入入-DNA 噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液， （已包装好含外源（已包装好含外源DNA），），37 1h。3)新鲜新鲜 LB 培养基培养基 稀释培养物。培养稀释培养物。培养 4-12 h ， 噬菌体颗粒达噬菌体颗粒达 1013 /L-1014 /L。 4. 加入固体加入固体 NaCI 和和 PEG -800，高速离心沉淀，高速离心沉淀 噬菌体颗粒噬菌体颗粒 5 . 蛋白酶蛋白酶K 处理处理 噬菌体悬浮液，苯酚噬菌体悬浮液，苯酚-氯仿氯仿 抽提，释放抽提，释放 入入DNA。 6. 乙醇沉淀乙醇沉淀DNA。第49页/共62页 此法抽提此法抽提 入入DNA 纯度不高，含染色体纯度

33、不高，含染色体DNA，程序简单。，程序简单。 第第4）改用）改用 CsCI 密度梯度离心密度梯度离心, 获得高纯获得高纯 入入DNA 样品样品。 三三三三. M13 单链单链 噬菌体噬菌体 载体载体 1. 单链单链 环状环状 性丝状性丝状 噬菌体，噬菌体， 特异性感染特异性感染 含性散毛结构的大肠杆菌。含性散毛结构的大肠杆菌。 2. M13DNA 所有基因都是所有基因都是 必需的，不能删除。必需的，不能删除。 第50页/共62页第51页/共62页 3. 通过通过 定点诱变，插入片段进行改造。定点诱变，插入片段进行改造。 1）通过定点诱变，封闭重复酶切切口。）通过定点诱变，封闭重复酶切切口。 2

34、）引入选择标记基因：启动子，操作子，）引入选择标记基因：启动子，操作子，-半乳糖苷酶氨基半乳糖苷酶氨基 端编码序列（端编码序列（LacZ ）的操纵子片段（）的操纵子片段（Lac ）组氨酸（）组氨酸（his ），抗生素抗性基因），抗生素抗性基因 3）人工合成多克隆位点接头片段插入标记基因内部，含重组）人工合成多克隆位点接头片段插入标记基因内部，含重组 子子 噬菌斑呈白色，含载体噬菌斑呈白色，含载体 DNA 的的 噬菌斑噬菌斑 呈蓝色。呈蓝色。 4）多克隆位点）多克隆位点 接头片段两侧改为统一测序引物序列，接头片段两侧改为统一测序引物序列， 分离分离 的重组分子的单链形式直接用于测序。的重组分子的

35、单链形式直接用于测序。第52页/共62页四噬菌体四噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体 噬菌体特征区域与质粒重组，具有优良性能。噬菌体特征区域与质粒重组，具有优良性能。 1考斯质粒考斯质粒 （Cosmid）1) 入入-DNA的的 cos 区与质粒区与质粒 DNA 重组，重组， 2) 入入-DNA 装载量装载量 23Kb ， 3) 入入-DNA 包装蛋白识别包装蛋白识别 cos 信号，与包装性质无关，信号，与包装性质无关， 用质粒取代用质粒取代 入入-DNA，大幅度提高外源，大幅度提高外源DNA装载量。装载量。 4) 入入-DNA-cos 位点及附近区域位点及附近区域 1.7 Kb 质粒质粒 3.3

36、Kb。 构成构成 考斯考斯 质粒共质粒共 5Kb, 5) 最大装载量最大装载量 45.9 Kb（50.9-5 Kb）。）。第53页/共62页2. 噬菌粒载体噬菌粒载体丝状噬菌体丝状噬菌体 DNA 复制起始点序列与质粒复制起始点序列与质粒 组成杂合子。组成杂合子。1）具有质粒基本性质，便于外源）具有质粒基本性质，便于外源 DNA 克隆及筛选。克隆及筛选。2）提高外源）提高外源DNA装载量，一般载体分子小其装载量大。装载量，一般载体分子小其装载量大。3）M13DNA 重组分子在复制时易发生重组分子在复制时易发生 DNA 缺失，噬菌粒重组分子则相对稳定。缺失，噬菌粒重组分子则相对稳定。4）常使用的噬

37、菌粒载体）常使用的噬菌粒载体 pGEM-3Zf 3.2Kb pUC118/pUC119 3.2Kb pZ258 4.9 Kb pEMBL 4.0 Kb第54页/共62页第55页/共62页 五动物病毒载体五动物病毒载体 1特点：向特点：向 真核细胞真核细胞 运载目的基因，运载目的基因， 动物病毒是理想基因工程载动物病毒是理想基因工程载 体。体。 1）整合性感染是病毒核酸整合到细胞染色体上，随复制而扩增。）整合性感染是病毒核酸整合到细胞染色体上，随复制而扩增。 2）序列中具有很强启动子，病毒感染细胞有大量拷贝高效表达）序列中具有很强启动子，病毒感染细胞有大量拷贝高效表达 3）在感染细胞中提取病毒）

38、在感染细胞中提取病毒 比细菌中提取质粒更好。比细菌中提取质粒更好。第56页/共62页 2 .杆状病毒载体（杆状病毒载体（ AcMNPV 裂解病毒）是昆虫表达系统。裂解病毒）是昆虫表达系统。 1）杆状病毒表达体系用于真核细胞内蛋白质修饰，加工，转运）杆状病毒表达体系用于真核细胞内蛋白质修饰，加工，转运. 2) AcMNPV 是非辅助性病毒。是非辅助性病毒。 3) 使产物呈溶解状态。使产物呈溶解状态。 4) 基因很大（基因很大（130Kb），克隆大片段的外源基因。），克隆大片段的外源基因。 5) 不感染脊椎动物，启动子在哺乳动物细胞内无活性。不感染脊椎动物，启动子在哺乳动物细胞内无活性。 6) 用于毒性用于毒性 蛋白质，癌基因表达，优越，可靠。蛋白质，癌基因表达，优越，可靠。 缺点：昆虫细胞培养周期长，技术较难掌握。缺点：昆虫细胞培养周期长，技术较难掌握。 第57页/共62页3. 痘苗病毒载体痘苗病毒载体 痘苗病毒痘苗病毒 ( Poxvirus) 是动物病毒中最大一类是动物病毒中最大一类 痘病毒。痘病毒。载体三个成分：载体三个成分：1. 调控序列，调控序列，2. 可插入外源基因限制性内切酶位点，可插入外源基因限制性内切酶位点，3. 胸腺嘧啶核苷激酶基因（胸腺嘧啶核苷激酶基因（tK)作用：