HPLC基础知识学习教案

1、会计学1HPLC基础知识基础知识目录目录第1页/共256页第2页/共256页第3页/共256页测定一些物理化学常数的目的第4页/共256页第5页/共256页第6页/共256页液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC） 随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC） 第7页/共256页子交换色谱法第8页/共256页利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 最近，又有一种新分离技术，

2、利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离第9页/共256页3. 3. 按固定相的外型分类按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱第10页/共256页4. 4. 按照展开程序分类按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为 洗脱法、顶替法、和迎头法洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图

3、第11页/共256页AB 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法第12页/共256页顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图第13页/共256页AB 此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物

4、质后，才能再使用第14页/共256页迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图 该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离第15页/共256页按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第16页/共256页按固定相在支持 体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第17页/共

5、256页适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物 分离原理图解优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好， 定量精度高，应用范围广缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分 子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多 第18页/共256页 HPLC是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域第19页/共256页应用领域应用领域分析对象举例分析对象举例环境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分农业土壤矿物成分、肥料、饲

6、料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分石油烃类族组成、石油中微量成分化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料材料液晶材料、合成高分子材料食品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃生物氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物医药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分第20页/共256页液-固吸附色谱液-液分配色谱离子交换色谱离子色谱离子对色谱排阻色谱亲和色谱（AC）第21页/共256页择性第22页/共256页第23页/共256页第24页/共2

7、56页第25页/共256页第26页/共256页第27页/共256页第28页/共256页第29页/共256页1. 1. 液液- -液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体，早期采用 100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料 （2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表 面附着一层厚度为1 2m 的多孔硅胶 表面积小，柱容量底第30页/共256页（3）化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅

8、氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 c. 硅碳键型：硅碳键型： SiC d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN C18 十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶 第31页/共256页（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定（3）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性（4）有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱 存在着存在着双重分离机制双重分离机制 (键合基团的覆盖率决定分离机

9、理) 高覆盖率：分配为主 低覆盖率：吸附为主 第32页/共256页2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等 结构类型：全多孔型和薄壳型结构类型：全多孔型和薄壳型 粒度：粒度：510 m第33页/共256页3.离子交换色谱分离固定相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树脂（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键 合型（键合离子交换基团） 树脂类别：树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性阳离子交换树脂（强酸性 、弱酸性）

10、、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性阴离子交换树脂（强碱性 、弱碱性）、弱碱性）第34页/共256页 4. 空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布第35页/共256页1. 1. 流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液

11、，洗脱剂。流动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况 （2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性 柱也称正相柱 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型 分离柱上的出峰顺序相反第36页/共256页2. 流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分按使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗 常用溶剂常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、甲醇 、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性

12、或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间第37页/共256页3. 流动相的选择流动相的选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙 醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳 二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)第38页/共256页（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止

13、微量杂质长期 累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝 固定相等（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀 并在柱中沉积（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检 测器时，流动相不应有紫外吸收第39页/共256页第40页/共256页第41页/共256页第42页/共256页信号信号进样ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰色谱峰第43页/共256页信号进样tM因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算，即 = L/tM第4

14、4页/共256页信号信号进样进样tR第45页/共256页某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的校正保留时间， 即 tR = tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间第46页/共256页第47页/共256页第48页/共256页定相选择性的指标，又称选择因子第49页/共256页区域宽度区域宽度第50页/共256页1.1.标准偏差标准偏差 即即0.6070.607倍峰高处色谱峰宽的一半倍峰高处色谱峰宽的一半2.2.半峰宽半峰宽Y Y1/21/2即峰高一半处对应的峰宽。它与标即峰高一半

15、处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰底宽度峰底宽度Y Y即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差截距间的距离。它与标准偏差 的关系是的关系是 Y = 4 Y = 4 第51页/共256页 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所 含组分的最少个数 (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分 析 (iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定 量分析 (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价 色谱柱

16、分离效能的依据 (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相 （或流动相）选择是否合适的依据第52页/共256页第53页/共256页第54页/共256页第55页/共256页effnkkn2)1(上式即为基本色谱分离方程式上式即为基本色谱分离方程式在实际应用中，往往用neff代替n处理上式可得)1(4effnR第56页/共256页1.分离度与柱效的关系 由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱

17、子，分离度的平方与柱长成正比，即2121221)(LLnnRR第57页/共256页第58页/共256页第59页/共256页如果设如果设， Q =（ n / 4 ） （ - 1 / ）那么：那么： R = Q （k / 1+ k）当当k10时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为为2-10最宜最宜控制控制k的方法：的方法：改变流动相的组成改变流动相的组成第60页/共256页从图中从图中tr /Q对对k的曲线可见，当的曲线可见，当k在在2 -5时，可时，可在较短的分析在较短的分析时间，取得良时间，取得良好的分离度好的分离度第61页

18、/共256页v水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长 (nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率吸光率第62页/共256页v溶剂的等级溶剂的等级 HPLC级级 优级纯优级纯 分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.2u的过滤的过滤,且除去有紫

19、外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质第63页/共256页甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己烷正己烷分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图第64页/共256页 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为 第65页/共256页第66页/共256页第67页/共256页第68页/共256页第69页/

20、共256页第70页/共256页3. 分配系数分配系数K与分配比与分配比 k 的关系的关系 K = kVS/VM =k . 其中称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为6-35；对毛细管柱，其值为60-600第71页/共256页 滞留因子Rs值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs rmssttuuR第72页/共256页第73页/共256页整理上面两式可得整理上面两式可得 第74页/共256页4.分配系数分配系数 K 及分配比及分配比 k 与选择因子与选择因子的

21、关系的关系 对A、B两组分的选择因子，用下式表示： = t R (B) / t R (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的 分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具 有实际意义第75页/共256页第76页/共256页浓浓度度沿柱移动距离沿柱移动距离 LABABKA KB 图中KAKB ，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点： 第77页/共25

22、6页第78页/共256页第79页/共256页 塔板理论假设：塔板理论假设：1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关第80页/共256页H的增大而减小 第81页/共256页塔板理论指出塔板理论指出：第一 当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板 数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲 线 第二 当样品进入色谱柱后，只要各组分在两 相间

23、的分配系数有微小差异，经过反复 多次的分配平衡后，仍可获得良好的分 离第82页/共256页第三第三 n与半峰宽及峰底宽的关系式为： n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 式中tR 与Y1/2 ( Y )应采用同一单位（时间 或距离）。从公式可以看出，在tR 一定 时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越 小，柱效能越高第83页/共256页在实际工作中，由公式 n = L / H和 n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM， 所以常用有效

24、塔板数n有效表示柱效： n有效有效= 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 ( tR / Y)2 有效板高有效板高 ： H有效有效 = L / n有效有效 第84页/共256页 塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观它用热力学的观点点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数 但是但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它

25、的应用第85页/共256页式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数上式也称范.第姆特（Van Deemeter）方程，速率理论吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素第86页/共256页涡流扩散示意图第87页/共256页由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定： A = 2dp上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关

26、，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此 A = 0第88页/共256页第89页/共256页B/u（纵向分子扩散项） 指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽B = 2 Dm式中： 弯曲因子，填充柱 4,000, 选择选择 300 的孔径的孔径第147页/共256页色谱柱填料孔径必须适合色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料待测物分子自由进出填料孔孔, 与孔内表面的键合与孔内表面的键合相进行分离分配相进行分离分配第148页/共256页键合类型键合类型 - 对色谱分离的影响对色谱分

27、离的影响单齿键合：单齿键合：提高传质速率提高传质速率, 加快色谱柱平衡加快色谱柱平衡双齿键合：双齿键合：增加色谱柱稳定性增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样增加色谱柱的载样量量CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO第149页/共256页碳覆盖率碳覆盖率- 对色谱分离的影响对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间低碳覆盖率：缩短运行时间封端封端 - 对色谱分离的影响对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟封端：减轻待测组份与硅

28、胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异选择性上有明显差异第150页/共256页 固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷 封端封端四甲基硅烷四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R = C8, C18, etc .OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)第151页/共256页0.09 in. = 2.33 mmSwagelok安捷伦安捷伦

29、1100液液相相ParkerValcoUptight0.09 in. = 2.33 mm0.08 in. = 2.07 mm0.09 in. = 2.33 mm0.13 in. = 3.37mm0.17 in. = 4.40mmWatersRheodyne第152页/共256页如果伸出的管线长度过长，可能漏液如果伸出的管线长度过长，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差 死体积区死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积第153页/共256页v分析结果重现性好分析结果重现性好v提高柱效提高柱效v降低柱压降低柱压v保证检测稳定性保证检

30、测稳定性 柱温箱的作用柱温箱的作用第154页/共256页分分 析析 柱柱 的的 维维 护护1.在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样，长时间未用的分析柱也要同样 处理处理2.定期使用强溶剂冲洗柱子定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品、净化样品5、分离条件、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯第155页/共256页第156页/共256

31、页其他影响柱效的因素其他影响柱效的因素第157页/共256页v改变改变k值的方法值的方法 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗与峰高的关系与R的关系第158页/共256页第159页/共256页第160页/共256页第161页/共256页第162页/共256页第163页/共256页第164页/共256页第165页/共256页第166页/共256页第167页/共256页第168页/共256页第169页/共256页第170页/共256页进样量和检测器响应的关系示意图进样量和检测器响应的关系示意图进样进样体体积积 检检测测器器响响应应值值定量定量环环体体积积的一半的一半3倍定量倍定量环环体体积

32、积全量注入全量注入部分注入部分注入第171页/共256页微量注射器微量注射器 红色表示残留样品红色表示残留样品第172页/共256页第173页/共256页第174页/共256页第175页/共256页开机开机流动相更换流动相更换进样进样图谱处理图谱处理流动相更换流动相更换关机关机第176页/共256页用必须重新过滤、脱气第177页/共256页第178页/共256页第179页/共256页梯度洗脱：梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：注意事项：v溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差v梯度混合的溶剂互溶性要好v梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性

33、检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）第180页/共256页吹氦脱气法吹氦脱气法加热回流法加热回流法抽真空脱气法抽真空脱气法超声波脱气法超声波脱气法在线真空脱气法在线真空脱气法流动相脱气流动相脱气第181页/共256页1.取下过滤头放在取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声的硝酸溶液烧杯中超声清洗清洗15分钟分钟;2.取出后用蒸馏水超声清洗取出后用蒸馏水超声清洗10分钟分钟;3.用吸球吹出过滤头中的液体用吸球吹出过滤头中的液体;4.再用蒸馏水超声清洗再用蒸馏水超声清洗10分钟分钟;5.用吸球吹净过滤头中的水份用吸球

34、吹净过滤头中的水份;6.将过滤头重新插入溶剂瓶中将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将正相系统注意将过滤头烘干过滤头烘干)溶剂过滤头的清洗溶剂过滤头的清洗第182页/共256页第183页/共256页第184页/共256页第185页/共256页第186页/共256页第187页/共256页第188页/共256页第189页/共256页3、待样品各组分峰出完后可停止数据采集并保存色谱数据第190页/共256页第191页/共256页第192页/共256页第193页/共256页 反相分配色谱反相分配色谱 极性极性: :固定相固定相 流动相流动相 固定相固定相 - - 极性极性 流动相流动相( (己烷己烷

35、, , 庚烷庚烷)- )- 非极性非极性 极性极性物质后出峰物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相正相 &反相色谱反相色谱第194页/共256页3 选择仪器类型，确定检测器及其参数2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤1 了解样品的有关情况，明确分析目的7a 回收纯化物质8 方法论证进入常规实验室7b 定量校正7c 定性方法6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件出的来，跑的快，

36、分的开出的来，跑的快，分的开第195页/共256页第196页/共256页1、分析大分子、小分子还是生物分子、分析大分子、小分子还是生物分子v一般常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系2、样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质、样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质v如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物3、测定是主成分、还是少量成分或痕量成分、测定是主成分、还是少量成分或痕量成分v主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器

37、的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等第197页/共256页第198页/共256页5、样品的溶解度、沸点、样品的溶解度、沸点v样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型v非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策v极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pH下区别可能很大v极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度v从溶解度可以判断出采用何种体系为佳v易挥发性的低沸点的物质在ELSD中难以检测v有存在特例第199页/共256页第200页/共256页第201页/共256页第202页

38、/共256页第203页/共256页第204页/共256页第205页/共256页第206页/共256页第207页/共256页第208页/共256页第209页/共256页第210页/共256页第211页/共256页第212页/共256页第213页/共256页第214页/共256页1 流动池脏，用极性试剂清洗。当有填料进入，拆开流通池2 检测器灯有问题，如能量偏低，更换氘灯3 周期性的波动，则起源于泵的脉冲，检修泵或更换垫片等4 温度对检测器的影响，控制温度5 气泡经过检测器，用大流量冲洗6 可能难出峰的样品连续不断出来，用强极性流动相冲柱7 流动相本底高，如水的纯度不够，换超纯水。或试剂纯度 不够

39、，换色谱纯的试剂8 注意数据采样和连接问题Time (min.)第215页/共256页第216页/共256页第217页/共256页1、样品分析时峰没出完，在下一针或下下一针出现，判断 办法，延长分析时间，计算可能出现的保留时间。然后 调整流动相2、连续进样，在某个位置出现忽高忽低的峰，最可能是进 样针污染，清洗进样针，注意黑垢的干扰，有些样品易 残留在针管里。可重新取样分析3、定量管污染，处理方法同上4、在死体积位置出现的小峰，可能是柱切换造成的5、流动相与样品溶剂不一致，也会出现鬼峰，尤其在低波 长时，出现位置在死体积的地方6、气泡，如果有小气泡通过流通池，也出现随机的假峰， 大气泡存在，其出现的峰往往直上直下，脱气解决7、样品发生变化反应，重新取样快速分析第218页/共256页1 有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的缓 冲液或离子对试剂，样品对pH变化极敏感2温度变化，当天气变化快，分析时间长，比较明显，用 柱温箱，空调解决此类问题3 流动相挥发，尤其用挥发性的酸时，时间长了酸度会发生变化，流动相新鲜配置4 仪器尤其泵的运行时间长后，重现性不好，仪器老化，在梯度分析时尤其明显，也可能流速不稳，或有气泡5 在分析某样品后，柱子可能发生改性，再次分析重现性变差，清洗或