高效液相色谱HPLC操作步骤及问题集锦

1、等浓度洗脱：开机步骤：1.配有机相，体积200ml（空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗4次），砂滤（用有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关。2. 开purge阀，把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中， purge，绿灯闪后关purge阀，把废液瓶放地上。3.打开软件，系统设置：确认添加LC-15C(A) ，确认柱温箱为（室温较低35，室温较高30）简单设置：LC时间：60min 波长：215nm模式：等浓度洗脱总流速：0.6ml/min下载（有机

2、相较少时改流速为0.5ml/min）点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。（若压力线与基线相差过大，则点击显示设置，修改强度范围，再点击检测器零点，快走平时调回原来的强度范围）4. 基线走完，不关泵开关，点击单次运行，改文件名和存储位置。5. 纯甲醇洗针三次，每次60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进样量40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸中再进样。6.进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。关机步骤：方法一：1.测样结束，点击停止，关泵开关，待压力降为0，开purge

3、阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中， purge，绿灯闪后关purge阀。2.简单设置：总流速：1.0ml/min下载点泵开关，洗脱柱子30min3. 在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次60ul，将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min，把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次，等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）4.黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。5.洗废液瓶、废液缸。方法二：1.测样结束，关泵开关，待压力降为

4、0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中， purge，绿灯闪后关purge阀。2.简单设置：总流速：1.0ml/min下载3.关软件，关SPD-15C开关左侧控制面板点击“PUMP”，洗针步骤同上4. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。5.洗废液瓶、废液缸。方法三：1. 测样结束，关泵开关：左侧控制面板点击“PUMP”，将阀往上推2. 调流速：Func连续摁直到出现“system change”，1为local，enter确定，摁CE退回到主界面。再次摁 Func使主界面光标移动

5、，数字键盘输入1.0ml/min，enter确定。3. 待压力降为0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge，绿灯闪后关purge阀。4. 摁 PUMP洗脱柱子30分钟，洗针步骤同上。5. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。6. 洗废液瓶、废液缸。 二元梯度洗脱：开机步骤：1.配有机相、纯水相，体积200ml（空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗4次），砂滤（用水膜/有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。开电源

6、总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关，LC-15C开关。2.把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀，把B管从纯甲醇中取出，同样靠壁几秒后放入纯水相中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀。3.打开软件，系统设置：确认添加LC-15C(A)，LC-15C(B)，确认柱温箱为（室温较低35，室温较高30）简单设置：LC时间：60min 波长：215nm走基线时前20分钟：模式：等浓度洗脱泵A流速：0.6ml/min泵B流速：0.4ml/min下载走基线后40分钟：模式：二元梯度洗脱总流速：0.

7、6ml/min泵B浓度：85% 下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min）点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。4.LC时间设置：设置需要的浓度梯度，注意前后浓度不一致时需平衡20min5.基线走完，点击单次运行，改文件名和存储位置。6.纯甲醇洗针三次，每次60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进样量40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸中再进样。7.进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。关机步骤：1.测样结束，关泵开关，待压力降为0，将A管从有机相中取出，放回纯甲醇

8、中，B管从纯水相中拿出，放回纯甲醇中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀。2.简单设置：模式：等浓度洗脱总流速 ：1.0ml/min泵A浓度：0.4ml/min泵B浓度：0.6ml/min下载点泵开关，洗脱柱子30min3.在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次60ul，将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min，把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次，等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）4. 黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C、LC-15C开关，关SPD-15C开关，关柱温箱

9、开关，关机，关电源总开关。5.洗废液瓶、废液缸。注：甲醇截止波长：210nm 乙醇截止波长：190nm当样品的最大吸收波长220nm，用甲醇作为有机相（便宜） 220nm，用乙腈作为有机相对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。*当有机相比例减小10%时，极性变小，洗脱时间变长，应相应调长20min的LC停止时间和结束时间。当降低检测器波长时（降到215nm），流动相从纯甲醇变为85%甲醇，走基线会出现鬼峰，且很难走平当流动相为80%甲醇时，出峰时间为22.5min，超过LC停止时间，则改变流动相为85%甲醇，提前出峰时间本实验室所用液相型号：柱型：C18化学键合相色

10、谱紫外检测器当点过单次运行，显示加入批处理队列时，点击“STOP”停止批处理队列，即可进样。明明有杂质却检测不出峰？1. 检测器是紫外检测器，而杂质可能几乎没有紫外吸收2. 有杂质的表现是压力线上移或者峰变形，而图显示峰变形，因此推测是较强的吸收峰将杂质包在里面而使得峰变形了为什么停止了单次运行后还能出峰但在再解析的图上却看不到停止之后这个峰？因为仪器只记录了停止运行前的数据，但之后检测器还是会进行检测，只是不再保存该数据。现象类型可能的原因解决方法基线漂移正方向：污染物积累/洗脱负方向（梯度型）：流动相“A”溶剂有吸收正方向（梯度型）：流动相“B”有吸收正方向（梯度型）：流动相“B”有吸收随

11、机性：温度变化随机性：温度变化波浪形：室内温度变化系统没有平衡检测池中有气泡保护柱被污染色谱柱被污染检测器污染流动相污染检测器灯老化使用梯度方法系统漏液流动相混合不准确试剂瓶中过滤头堵塞检测器灯老化清洗色谱柱，净化样品，用纯试剂用不吸光度或HPLC级试剂用不吸光或用更高的紫外波长用不吸光或HPLC级溶剂将柱和管路绝缘保温将柱和管路使用恒温柱箱监测和控制室温以10倍柱体积流动相平衡色谱柱对流动相进行脱气，然后将脱过气的流动相冲洗检测池不要超过检测池的坐高限压力更换保护柱使用合适的溶剂对色谱柱进行冲洗，如不能解决问题，更换色谱柱根据说明书清洗检测池使用新配制的HPLC级溶剂一般当灯的使用时间超过2

12、000h，应更换新灯使用更纯的溶剂或者更高的波长，如不能解决此问题则为正常现象检查或更换漏液管路或零件使用过程中，确保比例阀切换准确，但等度方法，手动配置流动相过滤头用水超声，然后用甲醇更换灯，特别是当灯的使用时间超过2000h基线噪声大随机性：污染物积累连续性：检测器灯故障偶然性：外界电干扰尖峰：检测器气泡冲洗柱，净化样品，使用HPLC级溶剂更换紫外灯（寿命1000h）使用液相色谱专用电源稳压器流动相脱气或反压调节器鬼峰上次进样的残留污染样品中不明干扰物离子对：破坏平衡肽谱：三氟乙酸氧化反相：水受污染尖峰：溶剂中气泡运行结束后，用强溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱以去除污染物样品净化或预分离在实际应

13、用的流动相中，制备样品使干扰减少到最小每天新配样品，使用抗氧化剂用不同量的水通过反相柱检查水的适用性且洗脱后测量峰高HPLC级的水溶剂脱气双峰进样量太大进样溶剂太强过滤砂芯堵塞柱有空隙火气沟存有未扫过的进样器流路旧的保护住色谱柱被污染色谱柱塌陷柱头有空隙柱子进样量超载进样量应为流动相进样量的1/6使用较弱的进样溶剂或流动相更换并用0.5m孔隙的在线滤片用玻璃珠或填料填满孔隙或重填柱更换进样器转子更换保护柱使用合适的溶剂对色谱柱进行冲洗，如不能解决问题，更换色谱柱更换色谱柱，所使用的pH不要超过推荐的范围用填充料或玻璃珠填充头部用更高负荷量的固定相增大柱直径减少进样量峰拖尾单峰：存在干扰成分双峰

14、的开始存在未扫的死体积碱性化合物：硅醇相互作用碱性化合物：硅醇相互作用硅胶基：柱降解硅胶基：硅醇相互作用旧的保护柱样品溶剂过强进样体积过大进样浓度过大色谱柱被污染旧的色谱柱色谱柱塌陷净化样品，预分离参阅上面的方法减少接头的数量保证进样器密封完好保证接头位置合适换成高聚物固定相用更强的流动相或加竞争碱(如三甲胺)使用特种色谱柱，高聚物柱或空间保护柱向流动相中加盐增加缓冲液浓度用pH耕地的流动喜爱那个抑制衍生溶质以改变极性相互作用更换保护柱确保样品溶剂低于或者等同于流动相的强度减少进样体积，避免样品过载，一般进样体积小于预计峰宽的40%减少进样浓度，避免样品过载使用适当的溶剂冲洗色谱柱，如果不能解

15、决问题，更换色谱柱旧的色谱柱比新的色谱柱柱效低，如果需要，更换色谱柱更换色谱柱，所使用的pH不要超过推荐的范围峰形展宽系统没有平衡样品溶剂过强进样量过大进样浓度过大柱外死体积过大温度波动旧的保护住旧的色谱柱污染的色谱柱色谱柱塌陷在进样阀中峰分散数据采集速率太慢检测器时间常数慢流动相黏度太高检测器容积太大保留时间长以10倍柱体积流动相平衡色谱柱确保样品溶剂低于或者等同于流动相强度减少进样体积，避免样品过载，降低进样溶剂强度使溶质集中减少进样浓度，避免样品过载减少进样管路的直径和长度，尽可能减少检测池的体积使用恒温控制的柱温箱，温度越高峰形越尖锐更换保护柱使用过离子对试剂的色谱柱，不要在运用与反相

16、色谱法忠旧的色谱柱比新的色谱柱柱效低，如果需要，更换色谱柱使用适当的溶剂清洗色谱柱，如果解决不了该问题，更换色谱柱更换色谱柱，所使用的pH不要超过推荐的范围在进样前后引入气泡以降低分散增加采样频率调节时间常数使之与峰宽匹配增加柱温用尽可能小的池溶剂用梯度洗脱或更强的流动相负峰折光检测器：溶质折射率小于溶剂折射率紫外检测器：溶质吸光度小于溶剂吸光度溶剂污染检测器信号线连接错误无故障，将极性调反使之为正用紫外吸收更低的流动相溶剂不要长时间循环使用新配制的HPLC级溶剂检查检测器的信号线的极性与记录仪的连接是否正确平头峰RI检测器未达到光学平衡离子对方法检测器过载检测器设置参考仪器说明书用流动相溶解

17、样品减少进样浓度检查检测器的衰减和回零前沿峰旧的或失效的色谱柱更换色谱柱小峰样品降解被分析物浓度低检测器设置使用新配样品增加被分析物浓度检查检测器，衰减和回零没有峰自动进样器没有清洗溶剂进样器损坏或者堵塞错误的进样量样品溶剂黏度过大检测器灯老化检查清洗溶剂瓶中是否装有易混合的溶剂自动进样器是否已经设定在两次进样过程中进行清洗更换进样针检查定量管的体积，采用部分定量管进样，则进样体积不应超过50%的定量管体积减少自动进样器的进样针取样时间更换灯，特别当灯的使用时间超过2000h漏峰样品分解流动相不互溶pH波动配制新样品进样检查色谱柱内溶剂与流动相是否互溶使用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱采用缓冲溶剂作流

18、动相，以控制离子化样品的保留多峰样品分解溶剂污染流动相不互溶pH波动保护柱污染色谱柱污染配制新的样品进样使用新配制的HPLC级溶剂，梯度方法常表现为“鬼峰”检查色谱柱内溶剂与流动相是否互溶，使用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱采用缓冲液作流动相，以控制离子化样品的保留更换保护柱使用适当的溶剂冲洗色谱柱，如果解决不了问题更换色谱柱保留变化系统没有平衡系统漏液，检测器密封垫失效温度波动色谱柱污染试剂瓶中的过滤头堵塞流动相混合不准确溶剂污染系统死体积不同活塞杆密封圈漏液流路或泵中存在气泡柱温不断变化平衡时间不足以适应梯度洗脱要求，或等度洗脱流动相起变化流动相组分选择性蒸发缓冲能力不足在线流动相混合不一致污染积

19、累最初几次进样-吸附在活性部位以10倍柱体积流动相平衡色谱柱更换漏液的管路或零件，更换密封垫片使用恒温控制的柱温箱使用适当的溶剂清洗色谱柱，如果解决不了问题更换色谱柱过滤头用水超声，再用甲醇使用过程中，确保比例阀切换准确，如果使用等度洗脱，手动配制流动相使用新配制的HPLC级溶剂，梯度方法c常表现为“鬼峰”对于梯度洗脱方法，应该检查新系统的死体积与以前系统的差异是否很大检查密封圈是否漏液或磨损，如有需求，更换密封圈确定试剂瓶与流路的管线完全充满，Primed阀关闭使柱恒温，绝缘，保证实验室温度恒定确信在溶剂改变或梯度结束后至少10个柱容积通过色谱柱减少氦气的剧烈脱气，保持溶剂储瓶盖好制备新的流动相用浓度大于20mmol/L的缓冲盐保证梯度系统输送恒定组分，与手动制备流动相核对冲洗色谱柱以去除污染物用浓样品进样冲洗柱，使基线处于正常状态保留时间逐渐增加流速在减慢硅胶填料的活化点键合固定相的流失流动相组成在变化硅胶填料的活化点硅胶填料的活化点固定液体流中的漏液调换泵密封垫，检查泵的涡流和气泡是用流动相改性剂保持流动相的pH为2-8.5（一般柱子）确保流动相容器盖好流动相中加竞争碱固定相用更高覆盖度的填充料压力波动逆止阀漏泵中有气泡泵密封口漏更换逆止阀脱气，通氦脱气更换密封垫压力渐增微粒积累水/有机系-缓冲液沉淀流