顾悦_Y05110108_SPR在细胞检测中的应用

1、 本科毕业设计 （论文）题目 SPR 在细胞检测中的应用 学 院 物理与电子工程学院 年 级 10 级 专 业 电子科学与技术 班 级 Y051101 学 号 Y05110108 学生姓名 顾悦 指导教师 李方强 职 称 论文提交日期 常熟理工学院毕业设计（论文）2摘要细胞生物学的众多研究项目一直被认为是生命科学研究领域的重要组成部分。虽然目前有大量的仪器应用于细胞检测，但其各自因具有需要荧光标记、灵敏度低、对细胞具有破环性、无法实时检测等一个或多个缺点而限制了细胞检测技术的发展。而基于表面等离子体共振（SPR）的传感方法是一种具有无需标记、高通量、高灵敏、可实时检测等特性的新颖光学检测方法。

2、因此，将SPR 技术应用于细胞检测的应用中具有十分重要的意义。 本文主要研究，表面等离子体共振（SPR）传感技术在细胞检测中的应用。利用 MATLAB R2012b 软件对基于角度调制的克莱舒曼型棱镜耦合传感模型的各参数进行数值仿真，得出各参数之间的相互关系。通过改变模型各参数，使其在中红外波段形成最强共振吸收峰（SPW），以增加激发波长的方式来增加检测深度，从而更准确可靠地完成一些与 SPW 相匹配的生物细胞的测量。关键字：SPR；细胞检测；中红外；仿真常熟理工学院毕业设计（论文）3AbstractCell Biology has been seen as a very important

3、part of life science research, and cell biology is one of the four basic life science disciplines in our country. There are a large number of instruments used in cell detection, but these instruments have one or more weak points, needing fluorescently labeled, low sensitivity, damaging cells, not re

4、al-time monitoring and etc, limiting the development of Cell Detection Technology. However, SPR sensor is a novel detection method, sensitive, high-throughput, without fluorescently labeled, capable of real-time monitoring and etc. Therefore, the SPR technology for cell detection application has ver

5、y important significance.This paper mainly studies SPR sensing technology in cell detection. To numerical simulation for each parameter of Kretschmann-Raether prism sensor model based on the parameters of angle modulation with MATLAB software. By changing the parameters of the model to be formed in

6、the maximum resonance infrared absorption peak (SPW), to increase the wavelength of the incident wave to increase the detection depth, thus completing the measurement more accurate and reliable SPW several matching the measurements of biological cells.Keywords: SPR; cell detection; infrared band; si

7、mulation常熟理工学院毕业设计（论文）4目录第一章 绪论 .61.1 概述.61.1.1 细胞检测的意义 .61.1.2 细胞检测技术的研究现状 .71.1.3 细胞检测技术存在的问题 .121.2 基于 SPR 传感的细胞检测.131.2.1 SPR 现象与传感原理.131.2.2 基于 SPR 传感的细胞检测技术概述.151.2.3 SPR 传感用于细胞检测的优势及瓶颈问题.171.3 课题内容和意义.18第二章 SPR 传感用于细胞检测的理论分析 .192.1 棱镜耦合式 SPR 传感模型.192.2 SPW 的特性.212.2.1 SPW 的传播特性.212.2.2 SPW 穿透

8、深度与激发波长的关系 .232.3 SPR 细胞检测模型的建立及分析 .242.3.1 细胞的等效折射率 .242.3.2 SPR 细胞检测的物理模型 .242.3.3 SPR 传感的灵敏度分析 .25第三章 SPR 细胞检测模型的设计 .263.1 Kreschmann SPR 传感模型的数值模拟.263.2 金属膜材料与厚度的选择 .283.2.1 金属膜材料的选择 .283.2.2 Ag 膜厚度的选择 .293.3 Ag 膜的制备工艺 .313.4 Ag 膜 SPR 细胞检测模型的可行性分析.31常熟理工学院毕业设计（论文）5第四章 总结与展望 .32参考文献 .33常熟理工学院毕业设计

9、（论文）6第一章 绪论1.1 概述概述1.1.1 细胞检测的意义细胞组学作为细胞生物学研究的一个前沿分支，它结合了基因组学、蛋白质组学与转录组学的技术等，主要对细胞结构以及内部 DNA 或蛋白质的功能进行研究。由此，细胞组学不仅能够使人类进一步认识到生命的过程，而且对于临床应用中疾病的诊断、进展预测与治疗也十分重要。自人类基因组图谱绘制完成后，生命科学就已经进入了后基因时代，对于DNA 序列的测定与遗传信息的解释也已经转移到了分子水平上的研究。从而，在分子水平阐述生命的奥秘，寻找诊断和治疗疾病的新方法与新途径。发展至今，大量的基因组与蛋白组的研究项目已成为了生命科学研究中的焦点。然而，基因位于

10、染色体上，基因表达而产生的蛋白质是在核糖体上合成的，生命体中的各种生化反应也都是在细胞中完成的。脱离了细胞而进行 DNA、蛋白质变化的研究，获得的数据往往与实际情况有较大差异。可以说，基因组只是定义了生物体的遗传潜力，但不能完全反映出环境因素改变时细胞整体功能性的改变，而细胞是生物体表现功能的基本单位。因此，对 DNA 与蛋白质的研究必须整合到细胞中进行，把生命过程中从基因到蛋白质的有关信息和细胞的结构与功能及细胞间的相互联系关联起来1，即只有在细胞层次上对 DNA 和蛋白质等生物分子进行的研究，才能够系统地、全面地认识它们的功能以及相互作用。由于在生命体中的各项活动都离不开细胞，在细胞层次上

11、对生物分子的研究已然成为新的研究热点。但是，研究层次的不同对技术手段与实验方法的要求也是不同的。目前，虽然蛋白质芯片、DNA 芯片等技术已趋于成熟，但其均脱离了细胞，无法适用于细胞检测。因此，研究生物分子在细胞水平上的实时检测技术更是刻不容缓。常熟理工学院毕业设计（论文）71.1.2 细胞检测技术的研究现状从人类首次用显微镜观测到细胞到现在，cell biology 的发展离不开新的检测技术，若没有技术层面上新的突破，对细胞研究的进展只能是极其缓慢并且十分困难的。纵观历史，细胞生物学的萌芽得益于光学显微镜的发明，随之各种各样的显微镜的相继问世又进一步推动了细胞生物学的发展，使之进入了更深层次的

12、研究。 而如今细胞生物学的研究早已发展到了分子阶段，迫切需要细胞分子检测技术的支持，对精度的要求也急剧提高。随着细胞生物学的发展，细胞的检测方法不再停留在光学显微镜阶段，而是向多元化发展。按不同检测方式所适用的范围来划分，细胞检测技术可分为几个方面：细胞的形态与生理功能方面，细胞接受外界的刺激方面，细胞内蛋白质之间的相互作用方面，细胞膜上的生理活动方面。1.1.2.1 细胞形态与生理功能检测人类对细胞最初的认识仅仅停留在形态结构上，但随着电子显微镜的问世，cell biology 的发展又迈出了重要的一步。人类对细胞的研究不再局限于光学显微镜时代形态上的构造，而由显微结构过渡到亚显微结构，随后

13、对细胞的功能性研究也开始起步，随着研究的深入，又推动了新的检测技术与仪器的发展。1.1.2.1.1 流式细胞仪细胞生物学早期的研究重心主要放在对细胞的分类与细胞形态结构的描述，传统的光学显微镜无法快速检测细胞的亚显微结构，也不能够便捷地得到细胞分类或细胞周期变化2的各种参数。为了克服传统光学显微镜的不足，于是便研发出了流式细胞仪（FCM） 。流式细胞仪的出现始于上世纪 70 年代，并在多个领域已经得到了广泛的应用，并向仪器功能增强化、分析快速化、使用智能化等方面发展。流式细胞仪是通过检测分析被荧光染色的细胞在不同散射角度的光散射光信号和荧光信号（荧光强度） ，从而获取细胞种类与数量等信息。常熟

14、理工学院毕业设计（论文）81.1.2.1.2 原子力显微镜随着人类对细胞的研究发展到微结构层次，对分辨率的要求进一步提高，原子力显微镜（AFM）便应运而生。AFM 具有原子级别的分辨率4，它主要通过对微弱力极其敏感的微悬臂上的针尖扫描待测样品时微悬臂随样品表面形貌上下起伏，激光照射在微悬臂背面，随着微悬臂的上下浮动，反射光也随之偏移，通过分析检测器获得的反射光光斑的偏移从而获得样品表面的形貌信息。AFM 应用在细胞研究项目上，不仅能够观测到细胞膜表面非常细微的结构，并且对膜的粘性以及膜上生物分子的识别等研究也同样适用。原子力显微镜能够提供样品的三维表面图且不需要对样品进行特殊处理，但由于成像原

15、理的特殊性，原子力显微镜对样品细胞的稳定性要求较高。AFM 通常有 3 种工作模式，非接触模式在室温大气下难以实现，而接触模式与敲击模式在扫描过程中又有可能损伤探针与待测细胞。因此，原子显微镜在细胞检测的应用中也存在着局限性。1.1.2.1.3 激光共聚焦扫描显微镜荧光标记法常用于细胞生理活动的研究中，并使用荧光显微镜来观测。随着共振能量转移技术的逐渐成熟，再加上荧光蛋白标记技术的发展，激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）成为了细胞形态结构、细胞生理活动研究的利器。LCSM 能够显示出细胞的立体结构，并且避免了光散射导致的图像信噪比低的现象，使图像的分辨率得以提高。LCSM 的基本结构如图 1.1

16、 所示，其主要由激光发射器、物镜、扫描模块与图像处理模块组成。LCSM 的缺点有：需要对待测细胞进行荧光标记，而激光又会快速漂白荧光蛋白5；荧光信号的捕获需要低噪音光电倍增管按点逐一进行，造成成像时间长且无法实时监控的缺点；激光照射在整个细胞上，但只有很少一部分的荧光受激发后被采集到，从而荧光信号的捕获效率低下。由此可见，LCSM 对细胞的检测难以做到实时的 3D 显示。常熟理工学院毕业设计（论文）9 图 1.1 LCSM 的基本结构图1.1.2.1.4 扫描电化学显微镜在对细胞的研究中，不仅用到了光学成像法，同时也用到了电化学检测法。扫描电化学显微镜（SECM）与 AFM 不同，它是通过使用

17、电化学的原理并能够对单个细胞进行实时监测的仪器。SECM 对单个细胞的的检测原理如下图 1.2所示，它具有一个超微电极（UME）作为检测时的探针，当探针离细胞表面非常近时，UME 上便产生了电流的变化，进而可以反映细胞的形貌与各种生理过程等。Ptsi gnl e cel lU M Ee-O2gl ucose+H2O2G OXdi f f usi ongl ucosegl ucosegl ucosePet ri di shEU M E=+0. 6Vvs. Ag/ AgC l , 3 M KC LA)Ptsi gnl e cel lU M Ee-O2l act at e+H2O2LOXdi f f

18、 usi onl act at el act at el act at ePet ri di shEU M E=+0. 6Vvs. Ag/ AgC l , 3 M KC LB)图 1.2 扫描电化学法原理图6常熟理工学院毕业设计（论文）101.1.2.2 细胞接受外界刺激检测当细胞受到化学药剂、生物分子等外界刺激时，它便会发生一些生理变化，例如细胞内的分子运动、细胞的形态变化等。而这些变化是可以通过发光、颜色变化、电位变化等特征来观测。1.1.2.2.1 电阻抗法电阻抗法最早被运用于细胞增殖、细胞形变与运动的研究中，它是一种以阻抗特性为检测依据的电化学检测方法。但随着技术的成熟化，电阻抗法被运

19、用于更多的生物细胞学的研究中，例如检测细胞的新陈代谢、细胞的应激反应等。电阻抗检测的检测过程一般为：将待测细胞偶联于工作电极上以增加电极阻抗；在适宜的频率下，检测对电极与工作电极之间的阻抗；解析电信号从而取得所需信息。电阻抗法的检测环境必须在溶液中，但溶液中电解所产生的离子以及其它的杂质又会干扰检测，使检测的可靠性下降。因此，细胞检测中使用电阻抗法同样也具有一定的局限性。1.1.2.2.2 共振波导光栅检测法CellEvanescent waveIncoupling lightOutcoupled lightG rat i ngW avegui deSubst rat e图 1.3 RWG 检

20、测细胞的原理图光学检测法因具有比电化学法更强的抗干扰能力、更高的分辨率而倍受青睐，各种光学检测法更是层出不穷。常熟理工学院毕业设计（论文）11在众多新颖的光学检测法中，共振波导光栅检测法（RWG）是一种利用衍射光栅（Grating）使光与光波导（Waveguide）耦合共振产生隐失场（Evanescent wave）进而实现检测折射率变化的检测方法。RWG 检测法无需标记，就可获取多项检测数据，例如发射强度、共振角以及共振峰的宽度等。经过分析这些检测数据，便能得到细胞受激后胞内分子的迁移情况，如图 1.3 所示细胞受 EGF 刺激因子作用。1.1.2.3 细胞膜上的生理活动检测1.1.2.3.

21、1 全内反射荧光显微镜C el lG l ass surf acen1n2Evanescent f i el dd=100-300nmO bj ect i ve l ensLaser beam图 1.4 TIRFM 检测原理图全内反射荧光显微镜5（TIRFM）的检测原理图如图 1.4，它通过隐失场激发出的荧光对细胞膜表面进行成像，它的激发深度能达到。相比之下，100nmLCSM 的深度范围内，因此，利用 TIRFM 对于细胞膜上生理活动500800nm:进行检测时信噪比较高。另一项对细胞研究具有重要意义的是，利用 TIRFM 对于细胞膜上生理活动进行检测还能有效的减少光漂白与光损害。利用 TI

22、RFM 对细胞膜的检测最大的优点是，形成图像的过程较简单速度较快且不需要进行扫描。TIRFM 虽然在成像时具有一大优势，但其由于要对细胞荧光标记也会在一定程度上对细胞造成功能性的影响。1.1.2.3.2 光子晶体检测法如上文所诉，荧光标记法虽然比较灵敏，但其也可能会影响细胞的功能。为了弥补这一缺陷，光子晶体检测法诞生了。光子晶体有着能产生 Bragg 衍射常熟理工学院毕业设计（论文）12的特殊性，而光子晶体检测法主要的检测原理就在于这一点，因此这种检测方法并不需要进行标记，其基本过程如图 1.5 所示。光子晶体检测虽然不需要对细胞进行标记处理，但其设计的过程需要复杂的理论推导与计算。再加上光子

23、晶体的制作也比较复杂，这大大限制了它的广泛应用。 - 图 1.5 光子晶体检测基本过程1.1.3 细胞检测技术存在的问题根据前文所述，归纳出多种常用细胞检测技术所使用的范围及其优劣对比，如表 1.1 所述。表 1.1 细胞检测技术的比较5 / FCM - AFM 1. 2. LCSM Ca2+ 1. 2. 3. SECM TIRFM 1. 2. 1. 2. 1. 2. 1. 2. RWG 1. 2. 3. 1. 2. 3. 由于细胞检测具有比基因检测、蛋白质检测更为严格的检测条件，细胞检常熟理工学院毕业设计（论文）13测的挑战更是不容小觑。细胞检测现阶段存在的问题主要有以下几点：1.细胞种类多

24、、尺寸差异大、特性各有不同。同种细胞还可细分为多种类型，即使是相同种类的细胞在形态特征上也存在差异，而且在不同的细胞周期也具有着不同表型。因此，为了保证检测的可靠性，在细胞检测时必须根据所测细胞类型选择相适应的模式系统，特殊情况下必须对细胞周期同步进行。2.在多细胞检测群体效应时，要求细胞要均匀覆盖在传感器上。3.在长时间的细胞检测中，细胞易失去活性，从而影响检测。因此，必须要尽量缩短细胞的检测时间或者给以合适的细胞生存环境来保持细胞活性。4.细胞膜是具有一定流动性的，而细胞的状态与环境温度往往会影响其流动性，使检测难度加大。不仅如此，细胞内部也会发生很多的生理过程，使干扰检测信号。因此，为了

25、保证实验的稳定性，并需要设立严格的对照组实验，来排除其它干扰因素对检测产生的影响。5.在细胞的研究中，为了全面地了解细胞的生理过程并能够做到定量分析，实时地监测各类相关参数显得很有必要。综上所述，细胞检测的无损化（无需标记） 、高通量、高灵敏、实时特性是当今细胞生物学研究的必然趋势。而基于表面等离子体共振（SPR）的传感器则是一种极具分子间相互作用检测潜力的新颖光学检测方法。因此，本文将SPR 传感技术与细胞检测技术相结合，试图找到新的方法来检测细胞上的分子反应，从而为细胞生物学的研究创造有利条件。1.2 基于基于 SPR 传感的细胞检测传感的细胞检测1.2.1 SPR 现象与传感原理SPR

26、是当入射光由光密介质入射到光疏介质并且入射角大于临界角时所激发的光学现象10。当光疏介质是复介电常数的金属时，并且在适宜的波长、入射角度、耦合方式、金属薄膜厚度等条件下，入射光从光密介质（玻璃）与金属界面发生全反射现象时会产生隐失场，从而使金属表面自由电子发生振动，表面等离子体波便在待测介质-金属界面产生，这种现象即是 SPR 现象。表面等离子体波，英文缩写为 SPW，它是一种沿待测物质与金属的界面传播的，并常熟理工学院毕业设计（论文）14呈指数方式减弱的 p 偏振电磁波。当发生 SPR 现象时，激发波几乎所有的能量都将被转化成 SPW 的能量，从而导致反射光光强大幅衰减。棱镜材料、金属膜材料

27、与厚度一旦确定后，SPR便会随着金属膜表面介质的折射率的变化而变化。 - 121212 SPW图 1.6 SPR 生物芯片的原理图当待测样品发生变化时，反射光的光强将会产生显著的改变，因此，SPR检测灵敏度很高。 如图 1.6 所示，以免疫反应为例，含有待测抗体的溶液流经芯片金属层表面，当抗原与抗体发生特异性结合时，金膜-待测介质界面的折射率将变大，从而使共振角（共振信号）变化。当发生 SPR 现象时，反射光光强与相位均会发生很大的变化，实时记录并分析共振信号的变化，便可定性定量的了解反应进行状况。如图 1.6 所示的是 SPR 信号的一条典型曲线，它反映了一些生物分子的特异性结合、解离等动态

28、过程，此种方法有着灵敏、实时、无需标记等优势。常熟理工学院毕业设计（论文）15 图 1.7 SPR 信号的典型曲线71.2.2 基于 SPR 传感的细胞检测技术概述SPR 传感比较适合检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，但其在细胞检测上的应用还在起步阶段。SPR 传感与 RWG 具有类似的检测原理，检测深度都能达到百纳米级，并且适用于检测细胞膜上发生的分子反应。不同之处在于发生SPR 现象时，SPW 的场强要比普通隐失场的场强要高出大约个数量级，由12:此可见，SPR 传感的检测信噪比更高。SPR 传感的检测深度会随着激发波长的增加而增加，而且只要能选择合适的激发波长就可对整个细胞进行检测。目前对

29、于在细胞检测研究方面的 SPR 传感大致可分成：1.红光 SPR 传感、2.近红外光 SPR 传感、3.SPR 增强型 TIRFM5。红光 SPR 传感红光 SPR 传感器的检测深度一般在之间，如图 1.8 所示，200300nm:等人根据不同的 SPR 共振角度，从而获得细胞膜特定位置和粘Karl -F. Giebel附（Focal contact）基底间的距离以实现对细胞表面粘附情况的研究。常熟理工学院毕业设计（论文）16图 1.8 细胞粘附情况8近红外光 SPR 传感近红外光 SPR 传感检测与红光 SPR 检测相比具有很多优势：1.更深的检测深度、2.更锐的共振峰、3.在传感层具有更高

30、的场增强效果等。等通过近红外波长扫描法利用傅氏变换红外光谱仪、SPR 传Anthony G.Frutos感器这两种仪器成功检测了超薄膜，并且论证了灵敏度与红光 SPR 传感在同一级别。由于检测深度在亚微米级的红光 SPR 传感与尺寸大小在微米级的细胞不相匹配，传统的红光 SPR 传感限制了细胞检测。然而，等在细胞检测Roy Ziblat研究中运用了 FT-SPR 技术成功检测了细胞膜中的磷脂膜，而且使检测深度也加深至大约。10 m一方面，近红外 SPR 的确有着较深的检测深度；但另一方面，较深的检测深度同样导致了一个问题：得到的信号是细胞内所有生理活动信号的混合，难以分离出特定生理活动的特定信

31、号。SPR-TIRFMTIRFM 所激发的隐失场能量比较弱，从而导致激发出的荧光强度也比较弱直接影响到了检测，而 SPW 场强比 TIRFM 所激发的隐失场大个数量级。12:因此，利用 SPW 场比隐失场所激发的荧光强度也会更强。结合 SPR 灵敏度与 TIRFM 的优点，SPR-TIRFM 应运而生，从而可以更加灵敏地检测细胞膜上的生理活动。等运用共光路相移干涉仪结合Ruei-Yu HeSPR 的方法，即 SPR-TIRFM，检测了细胞的粘附与运动特性，并且进行了对细常熟理工学院毕业设计（论文）17胞膜的成像。如图 1.9 所示为分别采用 TIRFM 与 SPR-TIRFM 技术得到的细胞膜

32、表面荧光图，使用 SPR-TIRFM 技术所得的右图具有更高的荧光强度。TI R FMSPR -TI R FM图 1.9 TIRFM 与 SPR-TIRFM 成像比较9SPR-TIRFM 技术虽然能得到更高的荧光强度，但其依旧要对样品进行荧光标记处理，检测信号依据荧光强度，从而不能避免荧光标记的缺点。SPR-TIRFM 虽然也利用到了 SPW 激发荧光团，但其并未使用到 SPR 无需标记的特点。1.2.3 SPR 传感用于细胞检测的优势及瓶颈问题SPR 传感用于细胞检测的优势：1.不需要对样品进行标记从而简化了操作过程；2.检测灵敏度高；3.可进行实时检测；4.根据不同的检测对象选择不同波长的

33、激发光，可实现细胞中各种生理过程的检测。SPR 传感用于细胞检测的瓶颈问题：1.细胞的种类和形态各不相同，其尺寸大小在之间。根据上文1m100m:所述，不同的入射波长激发不同的 SPW 穿透深度即不同的检测深度。所以，需要使用不同的入射波长来匹配不同的细胞检测。2.活细胞处于不同的细胞周期，并且其状态也会发生改变。因此，为了提高检测的可靠性，避免其他干扰因素，在检测时需要进行对照组实验。3.SPR 传感检测细胞，获取到的信号是所检测区域综合效应的信号，为了分离出某个特定的生理活动的信号，还需要通过复杂的算法解析获取的总信号。常熟理工学院毕业设计（论文）181.3 课题内容和意义课题内容和意义目

34、前，虽然细胞检测技术众多，但其大多要么需要对样品细胞进行荧光标记，要么不具备检测的实时性。然而，SPR 技术同时有着无需标记、样品无损化、高通量、可实时检测与高灵敏的特点，在细胞检测方面有着重要意义。当前，SPR 传感检测细胞的研究项目并不多，而且专门用于 SPR 检测细胞的商业检测仪器未出现。因此，研究适用于细胞检测的 SPR 技术十分迫切。本课题针对前文所述 SPR 传感系统应用于细胞检测方面的瓶颈问题，提出了一种解决方案。目前常用的棱镜传感系统是克莱舒曼型棱镜传感系统，通常有 5 层，为了方便研究可将其简化为三层，即：第 0 层是高折射率的棱镜层，第 1 层是金属（通常为金或银）薄膜层，

35、第 2 层是待测物质的传感层，如图1.10 所示。 012 图 1.10 三层结构的 SPR 传感模型本课题将会利用 Matlab 软件对基于角度调制的三层结构 SPR 传感模型的各参数进行数值仿真，得出各参数之间的相互关系。进而改变模型的各参数，使其在中红外波段形成最强共振吸收峰（SPW），激发波长的增加可以增加检测深度，更准确可靠的完成一些与 SPW 相匹配的生物细胞的测量。常熟理工学院毕业设计（论文）19第二章 SPR 传感用于细胞检测的理论分析2.1 棱镜耦合式棱镜耦合式 SPR 传感模型传感模型SPR 传感具有多种耦合方式，由于不同的耦合方式有着不同的适用范围，对于细胞检测方面，本文

36、针对棱镜耦合式 SPR 传感模型进行研究与分析。 012(a)Otto 012(b)Kretschmann 图 2.1 棱镜耦合结构如图 2.1（a）所示的 Otto 型棱镜耦合结构，在金属膜与棱镜底部存在一定厚度的空隙，这个空隙有入射光波长大小的厚度。待测物质就置于此空隙中，然后通过改变空隙或者金属膜的厚度来激发 SPW。因为空隙一般也就几百纳米，所以控制难度较大并且制作也不便，在实际的研究中很少用到 Otto 型结构。如图 2.4（b）所示的是克莱舒曼型结构，与 Otto 型最大的区别是其结构中金属薄膜层与光学棱镜底部紧密贴合，而待测物质是被放在金属膜的另一侧。通过控制光线入射角大小、波长

37、大小的方式来激发 SPR。若入射光线的入射角 大于零度且小于临界角，则会发生折射现象。为了避免这一现象的产生通常要做到两点：入射光线垂直于棱镜表面，使用半圆柱形棱镜或者等腰三角形棱镜11。半圆柱形的棱镜可确保以任意角度指向圆心的入射光线均与界面垂直，且光线进入棱形前后的角度不会发生改变。对于基于棱镜耦合的 SPR 研究，棱镜的折射率与待测介质的折射率比值越高，传感器的灵敏度也就越高。因此，提高灵敏度的一种方法是选用折射率高的材料来制作棱镜。产生 SPR 现象的条件：光波与 SPW 波矢相互匹配，即满足条件： （2-si nR ei nkk0常熟理工学院毕业设计（论文）201）上式中，为激发光波

38、矢，为激发光的入射角，为 SPW 波矢。0kink因为光从空气直接照射到金属表面，光波与 SPW 不法波矢匹配，所以必须要通过耦合的方式，从而使光波与 SPW 波矢能够匹配。如上文所述， ，本文选择 Kretschmann 型结构，通过入射角 in的改变，使光在棱镜-金属界面产生全内反射现象，由消逝波激发金属-传感界面附近的自由电子的振荡，从而产生 SPR现象，此时消逝波的波矢为： （2-2）02sinsinzininkk在实际的使用中 Kretschmann 型通常有 5 层（0 层为高折射率的棱镜层，1层为粘附层，2 层为金属层、3 层为调制/增敏层、4 为环境介质） ，为了方便分析，故简

39、化为 3 层结构。如图 2.5 所示，0 层为棱镜层，1 层为金属层，2 层为传感层。012xyz 如图 2.5假设传感层与金属层均为半无限大平面，SPW 波矢可表示为：sk （2-3）12122sk 上式中，为金属的介电常数，为被测样品的介电常数。由于金属层是12具有一定厚度的，所以的波矢只能近似等于为公式（2-3）右式。sk当消逝波与 SPW 达到共振时，即时zskk整理可得： （2-4）si ns 1212常熟理工学院毕业设计（论文）21入射角s为共振角。SPW 与消逝波相互作用，激发等离子体共振，入射光的能量绝大多数都被转移到了 SPW 上，反射光光强也因损失绝大多数能量而急剧下降。通

40、过分析反射光的光谱便能找出共振峰壑。在三层介质模型中，光强总反射率 R、反射光复反射系数 r0,2可用下列式子表示： （2-5）20.2Rr （2-6）0,11,2110,20,1 1,211exp 2 -11exp 2xxrrjd krjr rjd k（） （2-7）1,11- 0,1iii iiiri（） （2-8） 0,1,2iixiik（） （2-9）222- 0,1,2xiizkki（）上式中，ri,i+1表示为 p 偏振光在两个相邻介质层间反射的复反射系数，kxi表示为光波光波在穿越第 i 层介质时的波矢，kz表示为波矢在棱镜中的 z 分量，i表示为第 i 层膜的介电常数，d1表示

41、为金属层的厚度， 表示为入射波长。2.2 SPW 的特性的特性SPW 在传播过程中的衰减特性与 SPR 传感有着十分密切的关系。为了找到SPR 传感用于细胞检测方面的充足理论依据，所以首先要分析 SPW 的相关特性。2.2.1 SPW 的传播特性2.2.1.1 横向传播特性由公式（2-3） ，表面等离子体波的波矢与金属的介电常数密切相关，而金属的介电常数为复数。激发 SPR 现象的金属薄膜层的复介电常数实数部分为负数。当实部的绝对值远大于虚部的绝对值即时，表面等离子体波可mmmm:常熟理工学院毕业设计（论文）22表示为： （2-19）322222()mdmmdmdmmdii 如图 2.9 所示

42、的是在传感层中表面等离子体波的电场强度分布图，Z 轴为横向，表示 SPW 的传播距离，X 轴为纵向，表示 SPW 的穿透深度，颜色越深表示场强越大。从图中可以看出：表面等离子体波以一点为中心并向四周传播，且传播距离越长场强越弱。 xxz图 2.9 在传感层中表面等离子体波的电场强度分布5如图 2.10 所示的是表面等离子体波的传播长度与激发波长的关系图（选用金膜，传感层介电常数） ，由图可知，传播长度随着波长的增大而增21.33d大。激发波长为、时，传播长度分别为，其长度超650nm780nm20 m55 m过了一般动物细胞的直径，难于检测单个细胞，但可以检测群体细胞。图 2.10 表面等离子

43、体波的传播长度与激发波长的关系52.2.1.2 纵向穿特特性如图 2.11 所示的是入射光法线上场强与深度的关系图，由图可知，表面等离子体波在金属-传感层界面附近的场强最大，但在传感层中随着深度的增加场常熟理工学院毕业设计（论文）23强呈指数衰减，穿透深度即为 SPR 传感检测范围（金属层中场分布复杂且与SPR 传感关系不大而不做分析） 。图 2.11 入射光法线上场强与深度的关系52.2.2 SPW 穿透深度与激发波长的关系激发波长是 SPR 传感模型众多参数中极为重要的一个，其大小会直接影响到金属膜、棱镜、待测介质、的介电常数、SPW 的场分布等。表面等离子体波在传感层中的穿特深度可用下面

44、的式子表示： （2-20）1/24212ReddefdefmLnn上式中的为传感层等效折射率。如图 2.12 所示的是波长与穿特深度的defn关系图（选用金膜，传感层等效折射率） ，由图可知，激发波长越长，1.33defn穿特深度越深，即检测范围越深。因此，为了适应不同检测深度的要求可以选用不同的激发波长。常熟理工学院毕业设计（论文）24图 2.12 波长与穿透深度的关系图52.3 SPR 细胞检测模型的建立及分析细胞检测模型的建立及分析2.3.1 细胞的等效折射率SPR 传感检测细胞时，生物芯片的表面可看作是一层由细胞群均匀排列分布的介质层（传感层） ，传感层的折射率取决于细胞的折射率。细胞

45、种类众多、结构复杂，不同种类以及处于不同细胞周期的同类细胞的折射率也各不相同，各学者所测定的细胞各部分的折射率也不尽相同。其中的一组数据见表 2.1，表中数据来源于文献12。表 2.1 细胞各部分折射率类别细胞外环境细胞膜细胞质线粒体细胞核折射率1.351.461.371.41.39胞膜的厚度仅有，由于内的近膜区域（SPR 传感检测区域）主要510nm:是细胞质，胞内折射率可认为是，胞外折射率则为。1.371.352.3.2 SPR 细胞检测的物理模型由上文所述，不同波长的检测深度不同，而细胞一般的大小为，1100 m:因此可选用不同波长的激发波来满足不同细胞的检测要求。常熟理工学院毕业设计（

46、论文）25SPR 传感器最常用的激发波长为，其检测深度与细胞的尺寸相差较650nm远，只能检测到靠近金属层的细胞部分结构（近膜区域） 。若只是检测细胞的群体变化时，例如细胞形态变化、细胞受激反应等生理活动，可将传感层近似看作是一层均一的且各向同性的介质层，传感层折射率相同的均一介质模型适用。而倘若要区分总的趋势信号中的特定信号时，则均一介质模型不再适用，需要引入新的模型，即分层介质模型。其中，传感层 1为细胞膜外层，传感层 2 为胞内近膜层。2.3.3 SPR 传感的灵敏度分析2.3.3.1 均一介质模型的灵敏度分析xyzmd+ dLd 图 2.11 均一介质模型均一介质模型的灵敏度可用下式表

47、示： （2-21）333Re1 exp2ddefefddLnsnk n其中，为 SPW 的穿特深度。2kdL2.3.3.2 分层介质模型的灵敏度分析xyzmd1+ d1 1d2+ d2l 2Ld图 2.12 分层介质模型分层介质模型的灵敏度可用下式表示： （2-22）31331Re1 exp2defefddeflnsnk n （2-23）32332Reexp2defefddeflnsnk n常熟理工学院毕业设计（论文）26第三章 SPR 细胞检测模型的设计3.1 Kreschmann SPR 传感模型的数值模拟传感模型的数值模拟模拟时所用到的公式主要如下（公式（2-9） 、 （2-10） 、

48、（2-11）具体见 2.1.5 节）： （3-1）20,11,21x10,1 1,21x1r +r exp 2jdR=11+r r exp 2jdkk （j =）通过单一变量法，分别对各参量对反射率的影响进行仿真。不同的待测物质对反射率的影响根据前文所述的理论模型，假设棱镜的折射率 n0=1.55，取入射波长=650nm，选用银膜，介电常数 1=-17.6+0.5i，膜的厚度 d1=50nm，待测物质的折射率分别为 1.31、1.32、1.33、1.34、1.35，使用 MATLAB R2012b 进行仿真。565860626466687072747600.10.20.30.40.50.60.

49、70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入 n2=1.31n2=1.32n2=1.33n2=1.34n2=1.35图 3.1 不同待测物质的入射角与反射率关系如图 3.1 所示的是不同待测介质的 SPR 曲线，待测介质折射率在 1.33 左右。从图中可看出，不同的待测介质的反射率都存在一个极小值，它所对应的即是共振角。待测物质的折射率变大时，曲线向右偏移，即待测物质折射率越大共振角越大。棱镜折射率对反射率的影响常熟理工学院毕业设计（论文）27假设待测物质为纯净水，折射率 n2=1.33，取入射波长 =650nm，选用银膜，介电常数 1=-17.6+0.5i，膜的厚度 d1=50nm，不同棱

50、镜的折射率分别为1.5，1.6，1.7，1.8。同样采用固定波长 ，改变入射角 的方法进行仿真模拟。4651566166717600.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入 n0=1.5n0=1.6n0=1.7n0=1.8图 3.2 不同棱镜的入射角与反射率关系如图 3.2 所示的是不同棱镜的反射率与 p 偏振光入射角的关系。从图 3.2 中可看出，当待测介质固定时，入射介质（棱镜材料）折射率变大时，曲线向左偏移，共振峰越锐， SPR 现象比较明显。金属膜厚度对反射率的影响假设采用折射率 n0=1.55 的棱镜，待测物质为纯净水，折射率 n2=1.3

51、3，取入射波长 =650nm，选用银膜，介电常数 1=-17.6+0.5i，不同膜的厚度分别为30nm，40nm，50nm，80nm。采用与上述相同的方法进行仿真模拟。常熟理工学院毕业设计（论文）2860626466687000.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入d1=40nmd1=30nmd1=50nmd1=80nm图 3.3 不同厚度金属膜的 SPR 曲线如图 3.3 所示的是不同厚度金属膜的 SPR 曲线。由图可知，当金属膜的厚度小于 50nm 时，膜越厚 SPR 现象越剧烈。但当金属膜的厚度时，吸50dnm收峰逐渐变得不明显22。3.2

52、金属膜材料与厚度的选择金属膜材料与厚度的选择3.2.1 金属膜材料的选择不同材料的金属膜有着不同的介电常数，在其它条件相同的情况下，不同性质的金属膜所引起的 SPR 曲线差异较大。因此，合适的金属材料的选择对 SPR 传感细胞检测具有重要的意义。选择 Kretschman 型 SPR 传感模型，如图 2.5 所示。用 Matlab 软件分别对 Au 膜、Ag膜角度调制型 SPR 传感器进行数值模拟，其中的各项参数为：入射波长；金属=600nm膜的厚度为 50nm；Au 膜与 Ag 膜的介电常数分别为 Au=-8.77+1.37i20，Ag=-14.1+0.45i20；棱镜层折射率 n0=1.5

53、49；待测介质的折射率 n2=1.329；入射角的范围为 4989。常熟理工学院毕业设计（论文）2950556065707580859000.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入AgAu图 3.4 Ag 膜与 Au 膜模拟所得的 Ag 与 Au 膜的入射角-反射率曲线如图 3.4 所示。由图可知，在相同情况下，Ag 膜的半峰宽度小于 Au 膜的半峰宽度，即 Ag 膜的共振峰更锐，选用 Ag 膜具有更高的灵敏度。3.2.2 Ag 膜厚度的选择在 SPR 传感器中，不同的入射波长对应各自适合的金属膜厚度，合理的金属膜厚度能增强 SPR 现象使灵敏度提高

54、，上文所述的入射波长 600nm 时 Ag 膜所对应的最适厚度 50nm 已不再适用，需要重新选择金属膜的厚度。中红外波段的波长为，取入射波长，银膜的介电常数 1=-35 m:4 m834+48.8i20，采用折射率 n0=1.6 的棱镜，待测物质为细胞，近似取细胞质的折射率，不同膜的厚度分别为，进21.37n 20nm25nm30nm40nm50nm行数据模拟，获得角度调制型 SPR 曲线，如图 3.5 所示。常熟理工学院毕业设计（论文）3058.958.955959.0559.159.1559.259.2559.300.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入

55、入入 入 入d1=20nmd1=25nmd1=30nmd1=50nmd1=40nm图 3.5 波长为 4m 时不同银膜厚度的 SPR 曲线分析图 3.5 可知，在中红外波段，银膜的厚度为 25nm 左右且入射角度在59.05时，SPR 现象最为强烈。处于共振最强位置时，银膜的厚度增加或者减少都会导致最小反射率的增大即共振现象减弱。对银膜的厚度与反射率的关系进 一步分析，在以上基础上固定入射角度为59.05在银膜厚度为 0100nm 范围内的反射率进行数据模拟，模拟结果如图3.6 所示。由图可知，在 Ag 膜厚度为 27nm 时，反射率达到最低值为0.004709。因此，进一步优化入射波长为时

56、Ag 膜 SPR 细胞检测模型的4 mAg 厚度为 27nm。010203040506070809010000.10.20.30.40.50.60.70.80.91X: 27Y: 0.004709入 入 入入 入 入 入 /nm图 3.6 银膜厚度与反射率的关系常熟理工学院毕业设计（论文）313.3 Ag 膜的制备工艺膜的制备工艺采用磁控溅射（MS）技术制备 27nm 厚度的 Ag 膜，基底选用与棱镜折射率相同的玻片，镀膜前用超声波对玻片进行清洗，镀膜时玻片温度与室温相同，选用纯度的 Ag 靶材与 Ar24。99.99%选用直流电源，镀膜真空腔内真空度为。电压为，电流为-31.8 10 Pa3

57、20V，沉积速度为25。27nm 的 Ag 膜约用 13.1min，具体的 Ag 膜0.05A2.06nm/min的厚度可使用来台阶仪来测定。Alpha-Step 5003.4 Ag 膜膜 SPR 细胞检测模型的可行性分析细胞检测模型的可行性分析细胞的尺寸大小在之间，传统的红光 SPR 传感器的检测深度1m100m:仅仅在亚微米级，无法检测整个细胞。如 2.2.3 所述，激发波长越长，检测深度越深。因此，选用更长的激发波长来适应细胞级的检测深度。中红外波段的，根据公式（2-20）可算出 Ag 膜 SPR 传感在入射波长为红外波段时的35 m:检测深度大约在 5.51m15.37m 之间（入射波

58、长在 3m、4m、5m 时 Ag膜的介电常数分别为-471+20.6i、-834+48.8i、-1310+95.6i） ，而一般细胞的半径在 0.5m15m 之间。因此，中红外波段所对应的检测深度基本符合细胞检测深度的要求。实际的应用不仅需要理论上的实现，更需要加工工艺的支持，金属膜越薄对加工工艺的要求越高。制备 27nm 厚度银膜，可采用磁控溅射等技术都能使银膜生长均匀。综上所述，Ag 膜 SPR 传感 SPR 细胞检测模型在理论与技术上均能实现。常熟理工学院毕业设计（论文）32第四章第四章 总结与展望总结与展望本论文主要通过文献综述、理论分析、Matlab 数据仿真模拟等方法，对传统的基于

59、角度调制的 Kretschmann 型 SPR 传感模型进行综合分析，并通过优化模型的各参数，使其能在中红外波段对细胞进行检测。主要研究内容如下：第一章（绪论部分） ，对用于细胞检测方面的多种检测仪器与技术的特点进行了阐述与对比，并分析了 SPR 技术应用于细胞检测领域的优势、现状与瓶颈。第二章（理论分析部分） ，论述了 SPR 现象的产生条件，着重对 3 层结构的Kretschmann 型 SPR 传感模型进行分析，构建了 SPR 细胞检测模型。第三章（模型设计部分） ，首先，基于第二章 3 层介质模型光强总反射率公式，采用单一变量法，对不同待测物、不同材质的棱镜、不同金属膜厚度情况的 SP

60、R 传感模型分别进行了 Matlab 数据模拟，得出部分参数与总反射率 R 的相互关系。其次，使波长位于中红外波段来增加检测深度，并调整模型其它参数使其形成最强共振吸收峰（SPW）。最后，对此 SPR 传感细胞模型进行了可行性分析。随着 SPR 细胞检测理论与技术的发展，单一波长的 SPR 难以实现细胞的分层检测，多波长的 SPR 细胞分层检测技术将得以发展。随着各种技术的不断发展与融合，SPR 细胞检测的后续研究可与 MEMS 工艺、纳米技术相结合，设计高灵敏度的观测芯片，完成生物细胞的实时动态测量。常熟理工学院毕业设计（论文）33参考文献参考文献1 顾祖维. 细胞组学. 环境与职业医学,