黄曲霉抗性相关基因的表达分析-科学网—博客

1、中南民族大学硕士学位论文目录摘 要 .错误！未定义书签。Abstract.错误！未定义书签。第一部分：前言第一章 文献综述 .11.1.我国花生发展现状 .31.2.黄曲霉毒素对我国花生产业发展的影响.31.3. 花生黄曲霉抗性品种的研究进展.41.3.1固有抗性：果荚、种皮结构 .41.3.2固有抗性：种子的抗菌成分 .51.3.3诱导抗性的研究 .61.4黄曲霉抗性的研究难点 .81.4.1黄曲霉抗性的复杂性 .81.4.2黄曲霉抗性与其他抗性的联系 .81.5本研究的背景、内容和意义 .81.5.1研究背景 .81.5.2研究内容 .121.5.3研究意义 .13第二部分：材料与方法第二

2、章相关基因的克隆与测序 .152.1引言 .152.2仪器、试剂与材料 .152.2.1仪器、试剂 .152.2.1.2主要试剂 .162.2.1.3常用缓冲液、试剂的成分及配制方法.162.2.2材料.172.3实验技术路线 .172.3.1基因的 3 端克隆 .172.3.2基因的 5 端克隆 .182.4实验方法（3 端克隆） .192.4.1提取 RNA用品的除 RNA酶处理 .202.4.2 CTAB法提取发育中的抗性花生种皮的RNA.202.4.3反转录 cDNA第一链的合成 .202.4.4目的片段的 PCR扩增 .212.4.5目的片段的回收 .222.4.6目的片段与载体的连

3、接 .222.4.7氯化钙法制备感受态细胞及转化.222.4.8碱裂解法小量制备质粒 DNA.222.4.9 PCR法鉴定阳性克隆 .222.5实验方法（5 端克隆） .232.5.1提取 RNA用品的除 RNA酶处理 .231发育中花生种子黄曲霉抗性相关基因的研究2.5.2 CTAB 法提取发育中的抗性花生种皮的RNA.232.5.3去磷酸反应 .232.5.4.TAP 反应 .242.5.5接头连接反应 .242.5.6接头的准备 .252.5.7反转录全长 cDNA第一链的合成 .252.5.8全长 cDNA的富集 .252.5.9目的片段的 PCR扩增 .262.5.10目的片段的回收

4、与测序 .27第三章 黄曲霉抗性相关基因的表达分析.283.1引言 .283.2材料和方法 .283.2.1仪器、试剂 .283.2.2材料 .283.3实验技术路线 .293.4实验方法 .293.4.1提取 RNA用品的除 RNA酶处理 .293.4.2 CTAB 法提取发育中的抗性花生种皮的RNA.293.4.3反转录 cDNA第一链的合成 .293.4.4实时荧光定量 PCR.29第三部分：结果与分析第四章 结果与分析 .314.1引言 .314.2 cDNA3 端的克隆结果鉴定 .314.2.1 CTAB 法提取发育中的抗性花生种皮的RNA.314.2.2 3端克隆结果的质量鉴定 .

5、324.3全长 cDNA的克隆 .334.4荧光定量 PCR的结果鉴定 .354.4.1花生 RNA的质量鉴定 .354.4.2 cDNA 的质量鉴定 .364.4.3实时荧光定量 PCR分析 .374.5.tubulin（ AW350953， BI971077 ）； .384.5.1基因的表达模式 .384.5.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布.424.6.水通道蛋白（ AF047049）； .444.6.1基因的表达模式 .444.6.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布.464.7.SRP （ CD392810）； .494.7.1基因的表达模式

6、.494.7.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布.504.8类受体蛋白激酶（ AY163905）； .514.8.1基因的表达模式 .514.8.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布.532中南民族大学硕士学位论文4.9.核糖体蛋白L41（ CD399094）；53基因的表达模式53相似基因在不同的花生品种中的分布554.10.囊泡相关膜蛋白（BF423736）；56基因的表达模式56相似基因在不同的花生品种中的分布584.11. SHAGGY-LIKE KINASE （ BF595610）。59基因的表达模式59相似基因在不同的花生品种中的分布614.1

7、2总结62参考文献63致谢66附录攻读学位期间所发表的学术论文目录673中南民族大学硕士学位论文摘要本研究对前期基因芯片结果揭示的 8 个在黄曲霉抗性品种中上调表达的基因用荧光定量 PCR 的方法和生物信息学分析进行验证，并且在此基础上克隆黄曲霉抗性的相关基因。通过对发育中花生不同时期的果实和部位进行荧光定量 PCR 表达分析，了解其表达模式，寻找这些基因与黄曲霉抗性的关系。主要结果如下：（1）序列分析通过对测序的结果进行比对分析， 发现这 8 个基因可能有下述功能： AW350953（ alpha-tubulin）； AF047049（ channel protein1）； BI971077

8、 （ tubulinalpha3）；CD392810（SRP receptor protein）；AY163905（ receptor-like kinase）；CD399094（60s ribosomal protein L40） ；BF423736（vesicle-associated membrane protein725）；BF595610（ shaggy-like kinase）。（2）表达模式分析通过 blast est 分析，以及荧光定量 PCR 的结果发现：这 8 个都在果荚的发育中明显的表达，或者只在果荚中高表达。对比抗性与易感的品种的表达模式，除了 CD399094一个基因

9、之外，在抗性与易感的品种中其余的 7 个基因的表达的时期、部位和表达量都很相似，只是抗性品种中相应基因的主要表达时期早于易感品种。而 CD399094 基因在果荚中抗性与易感的品种的表达模式几乎完全相同， 只是与易感的品种相比 CD399094 在子叶的发育中也会出现高表达。（3）果实发育之初是黄曲霉抗性的一个重要时期通过表达模式分析发现，果实发育之初小果时期（本文中的名称），与黄曲霉抗性有着很大的联系。可能对花生果荚结构的形成有重要的意义，从而使果荚起到更好的黄曲霉天然屏障的作用。关键词：花生；荧光定量 PCR；alpha-tubulin； channel protein1；tubulin

10、alpha3； SRP receptor protein ； receptor-like kinase ； 60s ribosomal protein L41 ； vesicle-associated membrane protein725；shaggy-like kinase1发育中花生种子黄曲霉抗性相关基因的研究Ab s t r a c tIn this article, with the real-time pcr mothed, we confirm eight genes are possible related to Aspergillus flavus resistance, w

11、hich have been up-regulated in seed coats of Aspergillus flavus resistant strains by microarray chip analysis in previous study. We cloned these genes, and the sequences were compared and analyzed with bioinformatic methods betweenAspergillus flavus resistant and susceptible strains of developing fr

12、uits and seeds at different stages The results show as follows:（1）Sequence analyseBlastx nr results indicate the functions of genes studied are:AW350953（alpha-tubulin）；AF047049（channel protein1）；BI971077（tubulin alpha3）； CD392810（SRP receptor protein）； AY163905（ receptor-like kinase）；CD399094（ 60s r

13、ibosomal protein L40） ；BF423736（vesicle-associated membrane protein725）；BF595610（shaggy-like kinase）。（2）The expression profile analysisFrom numbers and distribution of similar ESTs in different developmental fruits and seed stages ofAspergillus flavus resistant and susceptible strains by blasen est

14、searching, and with real-time pcr assay, we found that their bear a similar express profile. Allof these 8 genes highly-expressed in fruit skin and expression levesl are low in mid-maturing seed skin. Some of them even nearly exclusively highly-expressed in fruit skin. Comparing Aspergillus flavus r

15、esistance strains with the sensitive ones, we found that they share some properties in common, the trend and the location of their expression level during the developing process are similar, the only difference is the gene expression peaks in resistance strains are earlier than in sensitive ones, ex

16、cept CD399094, which highly-expressed in cotyledon in mid-maturing phase of resistant strains.（ 3） The beginning stage of the fruit development is a very important stage for Aspergillus flavus resistanceThrough the expression profile analysis, we found that the beginning of the fruit development (sm

17、all fruit phase in this article) is a very important stage for Aspergillus flavus resistance. More of Aspergillus flavus resistance related genes relatively have much higher expression level in this stage may give birth to a stronger fruit skin, which will play a very important role in Aspergillus f

18、lavus resistance as a innate protection factor.Key Words：peanut；realtime PCR；alpha-tubulin；channel protein1；tubulin alpha3； SRP receptor protein ； receptor-like kinase ； 60s ribosomal protein L40 ； vesicle-associated membrane protein725；shaggy-like kinase2中南民族大学硕士学位论文第一章 文献综述1.1. 我国花生发展现状花生是世界范围内广泛种

19、植的农作物，在中国，自1993 年以来，据 FAO和农业部统计显示，年总产长期居世界第一位【1】。花生是我国重要的农作物，首先，它是高植物蛋白，脂肪的营养健康品，在公众的营养中起了重要的作用【2】。其次，花生油在我国植物油消费中占有很重要的地位，一方面是它现在占有的比重【3】 ；另一方面，则是公众对于花生油的需求量越来越大。同时，榨油后的花生饼还是良好的蛋白饲料（随着我国畜牧业的发展，蛋白类饲料的需求了越来越大）。值得特别指出的一点是： 花生在我国的出口行业中占有非常重要的地位，2003年，仅仅山东花生的原料出口就为444kt，创汇 2.98 亿美元；花生制品20kt，创汇2.17 亿美元【

20、4】 。不难看出，由于花生的自身的优良品质与口感，加上它高产等农艺性状，花生在我国发挥了，并将发挥更大的作用。但是，我国花生的产业的的发展同时也受到了很大的阻碍，其中的一个重要的因素就是黄曲霉毒素（AFTaflatoxin）的污染问题。1.2.黄曲霉毒素对我国花生产业发展的影响黄曲霉毒素是污染花生的真菌的次生代谢产物，这些真菌主要有黄曲霉（ asperillus flavus）和寄生曲霉（ asperillus parasiticus），而花生则是它们的最为敏感的农作物受体。黄曲霉毒素的最早的发现是在上个世纪的60 年代，当时在英国东南部一些农场中，有大约 10 万只火鸡不明原由地突然死亡，这

21、就是众所周知的“火鸡 X 病”。花生中常见的有黄曲霉毒素 B1、B2、 G1、 G2 和主要产生在花生乳中的 M1、M2，其中 Bl 毒性最强，危害最大，其次是 M1 。黄曲霉毒素对人和动物的毒性主要表现为致癌和致畸，实验结果显示，其毒性比人们熟知的剧毒物氰化钾要强 10 倍;比剧毒的农药1605 的毒性还要强 30 倍。一粒严重发霉含有黄曲霉毒素 40 微克的玉米，可使 2 只小鸭中毒死亡。黄曲霉毒素的毒害机理主要是抑制核酸的生物合成 (阻止 DNA 复制的起始阶段 )、抑制蛋白质的生物合成、干扰糖类和脂类代谢、抑制正常的免疫反应【 5、 6】。 黄曲霉毒素对花生产业的发展也是显3发育中花生

22、种子黄曲霉抗性相关基因的研究而易见的，首先，作为一个重要的农产品，不论是直接食用，还是加工；榨油；作为饲料，都会对公众造成直接或是间接的影响。而且这个影响可以达到非常严重的程度，在肝癌的流行病学的研究中发现，肝癌的发生地区与饮食的健康有着直接的关心，北美，西欧的发病率低，而亚洲与非洲的发病率高，而亚洲与非洲恰好是花生黄曲霉污染严重的地区【7】。同时黄曲霉毒素污染也对我国的花生出口造成了极大的影响。我国花生的主要出口地区欧盟，欧盟规定人类直接食用的花生及其制品中黄曲霉毒素 (B1 +B2 + G1 + G2 ) 从 20g/ kg 统一降到 4g/ kg ,其中 B1 2g/ kg，很多国家要求

23、无黄曲霉毒素危险（国际上将低于 5g/ kg 的检验结果视为无黄曲霉毒素危险） 。仅 2003 年，就有 19 批次， 353t 的花生及制品因黄曲霉毒素污染而被欧盟预警【4】。1.3 .花生黄曲霉抗性品种的研究进展花生抗黄曲霉的方法主要是农艺学的方法，而在目前的中国的耕作的条件下，很难彻底的实现，因而，获得黄曲霉的抗性品种有着很强的现实意义。然而，要获得花生的黄曲霉抗性品种并不是一件容易的事情，关于花生黄曲霉抗性的研究已经有40 年左右的历史，但是，依旧没有能够得到有效的黄曲霉抗性品种【 8】。但是纵观近来的黄曲霉抗性的研究进展，对抗性的认识已经有了长足的发展，总的上来说可以理解为两个方面，

24、固有抗性与诱导抗性。就好像人体的免疫系统一样，下面主要从这两个方面介绍，大体上的研究进展。固有抗性：果荚、种皮结构花生的果荚与种皮是花生种子的天然保护性结构，他们是抵御外界环境病虫害与微生物侵害的第一座壁垒，就像皮肤对于人体的作用一样。在现在，花生的果荚与种皮与黄曲霉抗性的研究已经在种皮的各个方面得到证实。这些研究主要分为两个方面物理和生化因素。物理因素；从花生果荚与种皮的显微和超显微观察显示，抗性与栅栏组织细胞的厚度、密度、裂缝和空洞有关。不同抗性水平的花生品种种皮纹理超微结构具4中南民族大学硕士学位论文有不同的特征。高抗型花生种皮的纹理结构与敏感品种不同 , 隆起细胞大体呈梯形或四边形 ,

25、 表面纹理呈条纹状或虎纹状纹理 , 气孔一般较小 , 这样的纹理结构牢固性好 , 不易破裂 ;亦或者空洞细胞很小 , 密度大 , 这样所形成的小孔网状的纹理 ,这样纹理的种皮亦不易破裂，有效的抵挡了黄曲霉菌的侵入因而表现抗病。高感型空洞细胞大 , 中空大或种皮易裂缝 , 黄曲霉菌更容易侵染。因此 , 花生种皮隆起细胞的气孔、空洞大小和种皮的牢固性与抗黄曲霉有关【 9】。 种皮蜡质层的厚薄，渗透性的强弱也是一个重要因素【 10】。与种皮结构的整体特征相对，种皮的特殊结构种脐在花生黄曲霉的抗性中有着非常重要的意义；研究发现，抗性品种的种脐一般较小且关闭，而黄曲霉敏感的品种的种脐一般较长且开放【11

26、】。化学因素；发现木质素和酚类化合物与抗性有关，比较抗性与敏感的荚果，发现，抗性的荚果所含有的木质素和酚类化合物比敏感的品种要高。在果荚中含有高比例的此类成分至少可以使荚果变得更加牢固 【12】。此外，在抗性品种中发现，种皮水溶性氮化合物的含量明显比敏感性品种低，其中包括：精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸【 13】。固有抗性：种子的抗菌成分与防止黄曲霉的入侵相比， 花生还有一种完全不同的策略抗菌成分， 这类物质可以抑制黄曲霉的生长，使其不能感染花生；或者它们可以单纯的抑制黄曲霉产生毒素，使即使感染了黄曲霉的花生也不会发生黄曲霉的污染。酚类化合物【12】植物体内的酚类化合物的抑菌效果主

27、要是通过多酚氧化酶和过氧化物酶作用发生的，在他们的作用下氧化成酮，从而抑制来自病原菌的果胶酶、纤维素酶等分解酶的活性。目前已经有12 种酚类化合物从花生的种皮和果荚中提取出来，他们的主要成分多为儿茶酸，原儿茶酸，P-香豆素，甲基儿茶酸。这些酚类化合物与黄曲霉抗性的研究已经开始，发现它们之中儿茶酸和甲基儿茶酚抑制黄曲霉菌生长的能力最强，而甲基儿茶酚和7-羟基香豆素抑制黄曲霉菌产毒的能力最强。虽然已经证实在体外这些酚类化合物的确有抗性作用。但是，在不同的花生的品种中并没有发现明显的酚类化合物种类的不同，而且在花生的果荚与种皮中这些酚类化合物的实际浓度并不是太高，还不足以起到抑制黄曲霉菌入侵的作用。

28、5发育中花生种子黄曲霉抗性相关基因的研究丹宁酸 (tannin)【12】与酚类化合物不同， 来自于花生种子中的丹宁酸是不可水解丹宁酸， 已证实它能够能抑制黄曲霉孢子的萌发，并且发现在不同的花生品种间，丹宁酸的含量差异较大，差别幅度约 16mg/g-97mg/g。此外，还有一些研究发现，除了抑制黄曲霉孢子的萌发之外，花生种皮中的丹宁酸还可以起到抑制黄曲霉菌菌丝生长的作用。类黄酮化合物已经发现花生种子中含有的类黄酮化合物主要是5,7-二甲氧异黄酮(5,7-dimethoxyisoflavone)。已经证实它能够抑制培养基中黄曲霉菌的生长，并且在不同的花生的品种中存在较大的变化 。但是，还未发现此类

29、化合物与花生的黄曲霉抗性间的直接关系。蹂花酸 (ellagic acid)蹂花酸是一种重要的黄曲霉菌产毒的抑制因子。 靴花酸平均含量在花生各部位分别为 :种皮 80mg/g，子叶 68mg/g ，荚果壳 42mg/g。靴花酸是黄曲霉抗性研究中的一个重要的化合物，在子叶中的蹂花酸含量甚至可作为抗黄曲霉育种的一种目标性状 。此外，一些研究还表明种子中的某些生化成分与黄曲霉的抗性有关。他们包括水溶性氮化合物和某些元素如P、Ca、 K 和 S的含量，但仍需进一步证实。诱导抗性的研究以上所有的研究都是研究的花生黄曲霉被动的防御性因素。 但是花生的黄曲霉抗性并不是只有被动的因素，他还有主动的，应激性的反应

30、。诱导性抗性的研究就是针对这一类的抗性的研究，它通过物理、化学以及生物的（黄曲霉）的因素来作用花生，使其发生一系列的生理生化的变化，来寻找黄曲霉的抗性因素。通过研究发现这是一个复杂的反应，存在在不同的类型，包括局部反应与系统反应。目前研究的比较多的是植保素以及一些酚类化合物，此外还有一些与过敏反应相关的生理生化反应。植保素植保素是一类在植物被病原菌侵染时快速积累的一类小分子抗菌物质。在黄色6中南民族大学硕士学位论文的黄曲霉的抗性研究中发现，这类物质的积累速度与积累量与花生的黄曲霉抗性相关。同时 wooton 等研究发现， 将花生种子切割成块后， 置于 25黑暗下培养可诱导产生植物保卫素，当其产

31、生的植物保卫素累积量达4.912.8g/ml 即可抑制黄曲霉菌丝的生长 。VICTOR S等.研究表明，二苯乙烯类植物保卫素在花生的抗病中起到了重要的作用。当花生植株的茎秆或是花在的果实受到了损伤的时候，这类植物保卫素的浓度在抗性品种中有较快的上升，而在易感品种中变化的速度要慢的多【14】。酚类化合物研究发现黄曲霉侵染可使花生种子固有的酚类化合物（上文已经提到它是一类与黄曲霉抗性相关的抗菌物质）发生变化。Fajardo(1994)用黄曲霉处理种子后，就发现虽然结合态酚类化合物含量在整个接种时期都降低，但是自由态酚类化合物含量一开始降低，但随后增加。主要的自由态酚P-香豆酸，阿魏酸和一个未知酚。黄曲霉的侵染可诱导阿魏酸、P-香豆酸以及自由态未知酚的增加。虽然研究发现，这些酚类化合物并不能够阻止黄曲霉的入侵，但是他们却可以有效的抑制黄曲霉