张克龙的毕业论文

1、本科生毕业论文（设计）题 目:VB6联合海金沙对草酸钙结石大鼠脾肾组织结构的影响 姓 名: 张克龙 学 院: 动物科学学院 专 业: 动物医学 班 级: 2011级2班 学 号: 1222110231 指导教师: 李静 职称: 副教授 2015 年 5月 24 日安徽科技学院教务处制目录摘要- 1 -关键词- 1 -引言- 1 -1 材料与方法- 2 -1.1 试验材料- 2 -1.1.1 试验动物- 2 -1.1.2 试验药品与试剂- 2 -1.1.3 试验主要仪器设备- 2 -1.2 试验方法- 2 -1.2.1 动物分组与给药- 2 -1.2.2草酸钙成石液的配制- 3 -1.2.3 动

2、物饲养- 3 -1.3 样品采集与检测指标- 4 -1.4 数据统计分析- 4 -2 结果与分析- 4 -2.1宰前活重和脾肾脏指标的变化- 4 -2.2各组肾脾脏切片观察- 5 -3 讨论- 6 -3.1草酸钙结石大鼠模型的建立以及成石液对大鼠肾组织结构的影响- 6 - 3.2草酸钙结石大鼠模型的建立以及成石液对大鼠脾组织结构的影响- 6 -4 结论- 8 -致谢- 8 -参考文献- 8 -英文摘要- 9 -VB6联合海金沙对草酸结石小鼠脾肾组织结构的影响动物医学专业2011级2班 张克龙 指导老师：李静（副教授）摘要：目的：探讨VB6联合海金沙对草酸结石小鼠脾肾组织结构的影响。方法：42只

3、大鼠按体重相近原则分为7组，I组作为对照组大鼠自由饮用纯净水，II至组作为实验组大鼠主要饮用成石液，成石液由1%氯化铵和1%乙二醇配置而成，至每组大鼠灌服药液，、组大鼠灌服生理盐水。组大鼠灌服定量VB6和低剂量海金沙水提取液， 组大鼠灌服定量VB6和高剂量联合海金沙提取液，组大鼠灌服定量VB6溶液，组大鼠灌服定量海金沙水提取液。灌服30d后，选取每组大鼠，宰杀并解剖获取脾肾脏。脾肾脏作常规切片,观察组织变化。结果：结石组小鼠肾小球萎缩，肾小管中可见块状黑色的草酸钙晶体；、组小鼠肾小管腔草酸钙晶体明显减少。结论VB6联合海金沙可有效减少肾脏内草酸钙结晶的数量，使脾结构恢复，白髓中脾小结较结石组明

4、显减少。关键词:VB6；海金沙；草酸钙结石；组织结构；脾；肾 泌尿系结石是泌尿系统的常见病，又称为尿石，是指在泌尿系统内因尿液浓缩沉淀形成颗粒或成块样聚集物，中医文献称其石淋、砂淋、血淋，发生于肾、膀胱、输尿管和尿道的任何部位，阻遏尿液的正常排出，以肾与输尿管结石为常见，肾结石成分多为草酸钙结晶1-2。泌尿系结石造成的机械性刺激性炎症可使肾小管上皮细胞受损，加速草酸钙结晶的附着3，引起尿路损伤，继发性细菌性感染，致使肾功能受损，以尿路梗阻、下腹部轻微疼痛或肾绞痛、排尿不畅为主要临床表现。近些年来，虽然泌尿系结石的防治研究取得了一定的进展，但仍无非常有效的治疗药物，发病率依旧居高不下，并且还有上

5、升的趋势。VB6 包括磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醇, 是氨基酸代谢中转氨酶的辅酶。VB6 在草酸生成上有极重要的作用。 当有足量的 VB6 时, 大部分的乙醛酸可以氨基化为甘氨酸, 减少草酸生成。 陈志强等4 发现, 给乙二醇结石模型大鼠补充大剂量 VB6 能明显的抑制脾肾草酸钙沉积。中药海金沙Lygodium japonicum( Thunb) sw是蕨类植物海金沙科海金沙属一年生草质藤本植物，广泛分布于广东、广西等地5 海金沙可全草入药，味甘淡，性寒，富含糖、酚和黄酮类化合物，临床用于治疗尿路感染、尿路结石、肾炎、水肿，具有清热解毒、利尿除湿之功效 6。对浓度1乙二醇与1氯化铵溶液采

6、用饮水模式模拟的大鼠草酸钙结石模型采用灌胃干预，制做肾脏脾脏组织切片并观察肾内草酸钙结晶及肾脏的变化，脾脏的变化，以探讨VB6联合海金沙对草酸钙结石大鼠脾脏.肾脏组织结的影响，为开发新药提供理论和实验依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物 由安徽医科大学提供的45日龄的SD级小鼠42只，雄性，体重250-300g，动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。1.1.2 试验药品与试剂 氯化铵（NH4Cl），沪试生产，分析纯，批号：F20050621。乙二醇（C2H6O2），国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯，批号：T20110608。维生素B6（1ml：50mg），贵

7、州天地药业有限公司，批号：H52020742；海金沙全草提取物（20:1），西安森然生物技术有限公司，批号SR2014517；生理盐水，国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯，批号：F20090105。安徽长临河医药科技有限公司生产饲料，主要营养含量：水份（10）、粗蛋白（18）、粗脂肪（4）、粗纤维（5）、粗灰分（8）。1.1.3 试验主要仪器设备分光光度计（SFZ1606016276型，由上海精密科学仪器有限公司生产）；低速离心机（TDL-50B型，由上海安亭科技仪器厂生产）；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50FBS型，由上海申安医疗器械厂生产）；生物苏泊尔电磁炉（SDHC04-210x型，

8、浙江苏泊尔股份有限公司）；立式美菱冰箱（BCD-350W型，合肥美菱股份有限公司）；微型漩涡混合仪（XW-80A型，由上海沪西分析器厂有限公司生产）；IEICA-RM-2128型切片机；LY-1型 展片机；OLYMPUS-CH30显微摄影系统；小鼠饲养笼具等实验中所涉及的常用仪器设备均由安徽科技学院动物医学试验室提供。1.2 试验方法1.2.1 动物分组与给药SD级雄性大鼠42只适应性饲养1W后，按体重相近原则分组，每组6只，染色笔标记然后编号。对照组、成石组、海金沙组、VB6组、定量VB6与低剂量海金沙组、定量VB6与中剂量海金沙组、定量VB6与高剂量海金沙组。1.2.2实验药品的配制建立草

9、酸钙结石模型小鼠(方法来自文献7)，草酸钙成石液为质量浓度1%氯化铵与体积分数1%乙二醇混合配置而成的溶液，具体操作是用电子天平称取氯化铵5g，用10ml规格的量筒量取5ml的乙二醇，同时用500ml的量筒量取500ml的纯净水，一并倒入量杯中，并用玻璃棒混匀。海金沙：原料（采回后，切碎，在真空干燥箱中60,0.08MPa真空干燥后，置于干燥器中备用）水提（将粉碎后的海金沙称取100g，加入八倍水浸泡，置于超声波清洗器中进行超声提取，抽滤，滤渣再重复过滤两次，收集滤液，再用旋转蒸发仪浓缩至膏状，定容到200ml容量瓶里，置于冰箱中冷藏备用）浓缩（将定容好的溶液脱水浓缩）浸膏喷雾干燥粉碎、混合、

10、包装产品。VB6：规格为（1ml：50mg)的注射液，贵州天地药业有限公司。1.2.3 动物饲养 大鼠饲养在安徽科技学院动物科学学院实验动物房进行，在苏州市新区枫桥净化设备厂生产的独立送排风笼具(Individual Ventitaled Cage,IVC)中进行饲养，大鼠的饲养管理及饲养环境、用具的清洗、消毒均严格按照标准化操作规范进行即每天固定时间换水换料，固定的时间给药，大鼠用水瓶每天固定时间清洗，用具每日固定时间紫外线消毒。使用刨花作为大鼠垫料，垫料首先在阳光下晒干，然后紫外灯照射34h，再装入自制的布袋中121高温蒸汽灭菌20min，最后置入干燥箱内60鼓风干燥后备用。 成石组和实验

11、组大鼠饮用配制好的成石液，空白对照组大鼠饮用自来水，大鼠自由饮水，环境温度2024，湿度5065%，光照1213h，每周定期称重一次。大鼠给药采用灌胃方式，对照组给予生理盐水，VB6组0.2g/kg体重，海金沙组按0.3g/k海金沙全提取物给药，高中低不同浓度海金沙-VB6三组，分别采用0.3g/kg海金沙+0.2g/kg VB6、0.6g/kg海金沙+0.2g/kg VB6和0.9g/kg海金沙+0.2g/kg VB6，持续4周。试验过程中认真进行大鼠的一般检查记录大鼠的精神状态、采食、饮水、活动、临床症状、环境温度与湿度及通风等情况。1.3 样品采集与检测指标试验期结束后，全部小鼠禁食12

12、h，不禁水，称量各组大鼠体重并作记录，然后各组小鼠双侧眼球摘除采血，采血后大鼠迅速解剖，取出两侧肾脏和脾脏，称量左右两侧肾脏的重量和脾脏，并计算肾体比、体比，肾体比（）=肾脏重量（g）/宰前体重（g）×100,体比（）=脾脏重量（g）/宰前体重（g）×100。肾脏用4中性甲醛固定，经不同梯度乙醇脱水、再用二甲苯透明、石蜡包埋，修块，用IEICA-RM-2128型切片机切片57m，中性树胶封片，显微镜下观察肾脏组织切片，用OLYMPUS-CH30显微摄影系统拍摄，通过所拍摄图片来观察比较脾肾组织结构的病理变化。1.4 数据统计分析试验数据均采用均数±标准差（M

13、77;SD）表示。本实验用SPSS19.0统计软件进行数据分析，采用Oneway ANOVA 数据分析方法进行差异性比较，<0.05为具有统计学意义。 2 结果与分析2.1宰前活重和脾肾指标的变化宰前活重肾体比（%）脾体比（%）285.13±37.151.74±0.50 0.24±0.04218.20±47.281.54±0.540.25±0.08 217.07±48.081.33±0.36 0.14±0.05 AB 194.48±44.08 1.26±0.29 0.17

14、7;0.05 B 宰前活重肾体比（%）脾体比（%）194.48±35.561.22±0.140.19±0.07 B 235.37±26.72 B1.32±0.26 0.17±0.05 B253.37±29.82 1.58±0.26 0.18±0.06 B注：与对照组比较， a表示 P<0.05，A表示 P<0.01；与结石组比较，b表示P <0.05，B表示P<0.01表1数据显示，结石组组肾体比略低于对照组组，但差异不显著(P0.05），组肾体比与对照组相近，差异不显著（P0.0

15、5），、的肾体比与结石组差异不显著（P0.05），无统计学比较意义，由表1可明显看出对照组的肾体比最高，可能与VB6联合海金沙的药配伍有关。与对照组相比，其余各组大鼠体重都有所下降，可能是由于成石液对消化道粘膜的刺激和肾组织的结构所导致的。结石租脾体比略高于对照组但差异不显著（P0.05），组脾体比与对照组差异极显著（P0.01），、与对照组脾体比差异显著（P0.05），与对照组相比，其余各组大鼠脾体比都有所下降，可能是由于VB6联合海金沙对脾脏的保护作用，使脾脏组织细胞恢复正常 ，脾肿大减轻。2.2各组肾脾脏脏切片观察各组肾脏图片 对照组成石组低剂量海金砂与定量VB6图1 图 2 图 3 定

16、量VB6和中剂量海金砂 定量VB6与高剂量海金砂 海金砂图4 图5 图 6 VB6 图7各组脾脏图片 成石组 对照组 低剂量海金砂与定量VB6图8图9图10 中剂量海金砂与定量VB6 高剂量海金砂与定量VB6 VB6图11 图12 图13图1可见正常对照组小鼠肾小球、肾小管结构正常，排列整齐，无草酸钙结晶。图2结石组中可见肾小囊、肾小球结构异常，排列杂乱，肾小管上皮细胞损伤，能见到不规则的大块黑色结晶体。图3低剂量海金砂与定量VB6组大鼠肾小球结构异常排列整齐,肾小球萎缩,肾小管结石减少,较结石组减少，图4肾小管腔内有大颗粒粒结晶体排列异常肾小球囊肿。图5中剂量海金砂与定量VB6组肾小球结构异

17、常有大颗粒结晶，图6肾小管内有较大结晶体，与结石组相似。图7组中肾小球结构异常,排列异常有大颗粒结晶。低剂量的海金沙和定量VB6、中剂量的V海金沙与定量VB6可相对有效保护肾脏的功效，高剂量的海金沙与定量VB6、定量VB6、定量海金沙效果相对较差。图8III组中对照组大鼠脾脏红髓和白髓结构清晰,白髓比较发达有明显的明区,暗区,与小结帽。图8结石组脾小结增多增大，较对照组有明显增多。图10脾结构较正常，白髓中脾小结较结石组明显减少。从图11可以看出脾小结相对正常，药物起到保护脾脏的功能。图12、13脾小结增多增大可能与药物的剂量过大引起体液免疫应答。由上所列举图片，可以得出低剂量的海金沙和定量V

18、B6、中剂量的海金沙与定量VB6可较有效地保护脾脏组织，抑制脾小结的的数量，有使脾脏组织结构恢复正常的趋势，有较好的治疗效果，但高剂量的海金沙与定量VB6和定量VB6组效果较差。3 讨论3.1 草酸钙结石小鼠模型的建立以及成石液对大鼠肾脏组织结构的影响乙二醇和氯化铵是制备草酸钙结石模型常用药物，但所用的剂量和给药途径目前尚无统一的标准，试验动物的品系、性别不同也会产生一定的差别，小鼠一般需要28-42d可形成草酸钙结石8。乙二醇在机体内可转化为草酸，从肾脏分泌排泄，氯化铵为酸性物质，可酸化尿液，具有肾毒作用，可损害肾小管，二者协同作用于机体，可形成泌尿系统的草酸钙结晶9。本试验中草酸钙结石模型

19、大鼠的制备方案中，成石液浓度为体积分数1%乙二醇与质量浓度1%氯化铵的混合溶液，自由饮水方式诱导，存在大鼠的摄入量控制不精确的问题，试验设计周期为30d，由表可知，结石组大鼠肾体比最高；图3、4结石组的肾脏切片显示成石液对小鼠有损害作用，肾小管上皮细胞损伤，管腔分布有块状黑色的不规则结石晶体，肾小管上皮细胞的损伤是结石形成过程中不可或缺的条件，与结石形成的早期病理变化有着密切的联系10-12，可以得出本次试验成功的诱导了大鼠结石的形成，草酸结石模型建立成功。在试验期间，对照组大鼠的精神状态良好，给小鼠灌胃时有很强的应激反应， 5个干预组大鼠的精神状态较差，不喜活动，造成此现象的主要原因可能是成

20、石液、各干预组药液对大鼠的胃黏膜以及肾脏刺激的作用，使得这两组大鼠的精神状态较差。结石组肾体比最高，主要原因可能是钙结晶在成石组大鼠肾中附着和沉积，也可能与成石液对尿路的损伤有关。3.2草酸钙结石小鼠模型的建立以及成石液对大鼠脾组织结构的影响本试验中草酸钙结石模型大鼠的制备方案中，成石液浓度为体积分数1%乙二醇与质量浓度1%氯化铵的混合溶液，自由饮水方式诱导，存在大鼠的摄入量控制不精确的问题，试验设计周期为30d，由表可知，结石组大鼠肾体比最高图8III组中对照组大鼠脾脏红髓和白髓结构清晰,白髓比较发达有明显的明区,暗区,与小结帽。图8结石组脾小结增多增大，较对照组有明显增多。图10脾结构较正

21、常，白髓中脾小结较结石组明显减少。从图11可以看出脾小结相对正常，药物起到保护脾脏的功能。图12、13脾小结增多增大可能与药物的剂量过大引起体液免疫应答。 由上所列举图片，可以得出低剂量的海金沙和定量VB6、中剂量的海金沙与定量VB6可能较有效地保护脾脏组织，抑制脾小结的的数量，有使脾脏组织结构恢复正常的趋势，有较好的治疗效果，但高剂量的海金沙与定量VB6和定量VB6组效果较差4 结论VB6联合海金沙可较有效减少肾小管内草酸钙结晶的数量，使脾结构恢复，白髓中脾小结较结石组明显减少，发挥预防和治疗草酸钙结石的功效起到保护肾脏组织和保护脾组织中脾小结的作用。致谢值此论文结束之际，向我的论文指导老师

22、李静副教授表示崇高的敬意和衷心的感谢，同时也非常地感谢帮我一起完成实验的老师和同学们的支持与帮助。李老师在论文上严格要求、耐心指导、深入启发，在论文的选题、设计、完成等方面倾注了大量的心血。老师孜孜不倦的追求精神，严谨的治学态度，高尚的人格是我永远学习的楷模！感谢李静、贺绍君、李文超等老师给予本论文试验操作过程的热情悉心的指导和大力的支持！参考文献1黄明坦,梁国挺,叶泽兵.泌尿系统结石临床综合观察J.当代医学,2011,17(27):113-114.2An Z,Lee S,Oppenheimer H,et al. Attachment of calcium oxalate monohydrat

23、e crystals on patterned surfaces of proteins and lipid bilayersJ.Am.Chem.Soc.2010,132(38):13188-13190.3Fasano J M, Khan S R. Intracellular crystallization of calcium oxalate in the presence of membrane vesiclesJ.Kidney Int,2001,59:169-178.4陈志强， 章咏裳.三种维生素对大白鼠草酸钙肾结石形成的影响J .中华实验外科杂志， 2005，11(5):293-294

24、.5张雷红，范春林，叶文才，等.海金沙草黄酮及酚酸类化学成分的研究J中药材，2008，31 ( 2) : 2242266张雷红，叶文才，杜敏海，等 金沙科植物的化学成分及生物活性研究进展J 天然产物研究与开发，2007，19( 6) : 552557 7蒋一强,李山，吴闯，等.玉米须及芭蕉芯对小鼠肾草酸钙结晶抑制作用的形态定量研究J.成都中医药大学学报，1999,22(3):37-38.8蔡华芳.草酸钙肾结石模型及其应用J.中国中西医结合肾病杂志,2010,11(8):750-752.9钟玲，苏泽轩.乙二醇法复制肾结石模型给药途径和方法的比较J.中国病理生理杂2000,16(4)：381-38

25、2.10Saeed R. Khan. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stonesJ.Nephron Exp Nephron.2004,98:55-60.11Liang L, Chen J, Vittal R ,et a. Expression profiling of crystal一induced injury in human kidney Epithelial cellsJ.Nephron Physios.2006,103(1):53-62. 12邵绍丰，翁志梁，李澄棣，等.单味中药

26、金钱草、石韦、车前子对肾结石模型大鼠的预防作用J.中国中西医结合肾病杂志，2009，10(10)：874-876.Effect of oxalic acid stones VB6 United Lygodium splenic renal functionAnimal Medical Professional 2011 two classes Zhang KelongInstructor: Li Jing (Associate Professor)Abstract: Objective To investigate the effect of VB6 combined with Sea San

27、ds on the structure of spleen kidney in mice with oxalic acid. Methods 42 rats according to the weight of similar principle is divided into 7 groups, I group as control group rats, drinking pure water, group II to VII as the rats of experimental group drinking liquid stone, stone liquid by 1% ammonium chloride and 1% ethylene glycol configuration, III to VII rats irrigation liquid, group I and group II rats filling the physiological sa