不同浓度的ABA对马铃薯试管苗结薯的影响

1、内蒙古农业大学士学位论文不同浓度的ABA对马铃薯试管苗结薯的影响学院：农学院专业:植物科学与技术学号：100213071姓名：董艳慧指导教师：乌兰巴特尔论文提交时间：二0一四年六月摘要马铃薯是我国重要的粮食及经济作物，在农业生产和人民生活中占有非常重要的地位，病毒病是马铃薯获得高产稳定的一个重大障碍，茎尖脱毒被认为是克服这一障碍的有效途径。本试验系统的研究了激素ABA浓度对马铃薯试管苗发育及薯诱导的影响，主要结论如下:1.暗培条件下1umol/LABA最利于试管薯的形成，光暗间断条件条件下5umol/L ABA最利于试管薯的形成。2.随着ABA浓度的升高试管苗的地上部和匍匐茎的生长逐渐减弱。3

2、.当ABA浓度低于1umol/L时，随着ABA浓度的升高块茎的生长速度逐渐增加，大于1umol/L时随着ABA浓度的升高块茎的生长速度逐渐减慢。关键词：马铃薯，微型薯，ABA浓度Potato tissue culture and in vitro induction of potatoPotatoes are the important food and cash crops in our country, in the agricultural production and people's life occupies a very important position, virus

3、 disease is a major obstacle to potato yield stability, seedling stem tip is considered to be an effective way to overcome this obstacle.This experimental system to study the hormone ABA concentration of tube seedlings growth and potato potato induction, the influence of the main conclusions are as

4、follows:1. Under the condition of dark 1 umol/LABA most conducive to the formation of the test tube potato, light dark gap condition under the condition of 5 umol/L ABA most conducive to the formation of the test tube potato.2. With the increase of ABA concentration in the test tube seedlings of abo

5、veground growth weakened and stolons.3. When the ABA concentration is lower than 1 umol/L, with the increase of ABA concentration of tuber growth rate gradually increased, greater than 1 umol/L with the increase of ABA concentration of tuber growth speed slow down gradually.Key words:potato,minitube

6、r, ABA concentration目录1. 前言11.1 马铃薯概况11.2 马铃薯的繁殖方式11.3马铃薯组织培养的研究进展21.4不同激素对马铃薯试管薯形成的影响31.4.1 细胞分裂素对块茎形成的影响41.4.2脱落酸对块茎形成的影响41.4.3生长素对块茎形成的影响41.4.4乙烯对块茎形成的影响51.5研究的目的和意义52材料与方法63.结果与分析73.1 不同外源ABA浓度对试管薯结薯的影响73.2 不同外源ABA浓度对试管苗生长情况的影响94. 结论与讨论11致谢13参考文献141.前言1.1马铃薯概况马铃薯原产于南美洲安第斯山区的秘鲁和智利一带，十六世纪中期，马铃薯被一个

7、西班牙殖民者从南美洲带到欧洲，1650年马铃薯已经成为爱尔兰的粮食作物，并开始在欧洲普及，十七世纪时，马铃薯传播到中国，很快在内蒙古，河北，山西，陕西普及。马铃薯是茄科茄属一年生草本植物，是一种分布广泛，适应性强，产量高，营养丰富的粮菜作物，工业上它也是具有多种用途的高产经济作物，是世界上十大营养食品之一，据分析：每100g马铃薯中含有蛋白质1.52.3g，碳水化合物17.528.0g，脂肪0.4-0.94g,钙11-60mg，还含有各种微量元素，马铃薯的蛋白质结构与人的蛋白质结构相似，它的营养成分可以被人体很好的吸收利用。马铃薯中含有丰富的膳食纤维，有助促进肠胃蠕动，疏通肠道，含有丰富的维生

8、素B1,B2,B6和泛酸及大量的优质纤维素，马铃薯“性平味甘无毒”，能健脾和胃，具有一定的通便排毒的作用。1.2 马铃薯的繁殖方式马铃薯栽培种为多倍性作物，它可以进行有性繁殖，也可进行无性繁殖。有性繁殖：在自然条件下马铃薯能开花，结出浆果并结出实生种子，种子可以长成植株，这种用种子长出植株的繁殖方式就是有性繁殖。无性繁殖：马铃薯的无性繁殖包括块茎繁殖.扦插繁殖.嫁接繁殖.分株和压条繁殖及组织培养繁殖1。目前大田栽培多数采用块茎繁殖，但是这种繁殖方式存在一定的弊端，种薯用量大，繁殖系数低，并且连年种植容易导致病毒积累2，产生严重的品质退化，Monel通过反复试验成功剥离马铃薯茎尖得到无病毒植株，

9、形成了真正意义的马铃薯脱毒生产技术。随着组织培养.茎尖剥离技术的应用和推广，有效的解决了马铃薯品种退化的问题。植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是指在无菌条件下,将离体的植物器官(如根，茎尖，叶，花，未成熟的果实和种子等)，组织(如形成层，花药组织，胚乳和皮层等).细胞(如体细胞，生殖细胞等)，胚胎(如成熟和未成熟的胚)或原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织和潜伏芽等,进而培育成完整的植株,统称为植物组织培养。由于是在试管内培养,而且培养的是脱离植株母体的培养物,因此也称之为离体培养或试管培养。根据

10、外植体来源和培养对象的不同,又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等.马铃薯试管薯是在脱毒试管苗之后发展出的无毒种薯的新技术之一，即通过组织培养于容器中培养试管苗,在一定诱导条件下诱导叶腋处形成小薯,直径在 210 毫米之间.之后又发展了许多培养和诱导试管微型薯的方法和技术。诱导其结薯的方法很多，诱导微型薯的试验也有相关的报道，黑龙江省农业科学院马铃薯研究所将培养于三角瓶固体培养基中 28-35 天的无毒苗，在无菌条件下剪去顶小叶和基部作为基础培养物3。罗玉等认为÷结薯和外植体切段的生理年龄和健壮程度有关，生理年龄老的切段比幼的切段易于结薯，结薯也较早3，多数研究

11、者以试管苗整株为诱导基础材料。李灿辉等以二节茎段为诱导基础材料，贾长胜等以一叶茎段为材料，都可诱导结薯4。1.3马铃薯组织培养的研究进展依靠自然条件在繁殖珍稀植物，价值较高的植物或是人类生产生活大量需要的植物，受地理环境和季节的限制，很难达到快速繁殖，满足需要的目的，而组织培养可以轻松的解决这一问题，我国的组织培养相关类研究工作，是从马铃薯去除病毒，建立马铃薯无毒苗体系开始的。早在30年代初,我国两位已故的著名科学家罗宋洛和李继侗就已经是远东植物组织培养的先驱者。罗宋洛教授研究离体根尖培养的适宜条件,李继侗教授发现了胚乳提出物对离体胚发育的促进作用。我国的组织培养工作一直都在不断的研究之中,从

12、20世纪50年代我国植物组织培养创始人之一罗士韦教授在中国科学院上海植物生理研究所开展了组织培养的研究以来,植物组织培养技术已有丰硕的研究成果.在近10多年来其发展更为迅速,全国各地许多农业科研院所和高校都开展了植物组织培养研究工作,对农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物进行组织培养研究并取得了成功。我国于70年代初,由吉林农业大学，辽宁省农科院和黑龙江省克山农科所对茎尖组织培养进行了初步试验,取得一定的进展。 1976年建立了我国第 1 个马铃薯脱毒原种场,从此开始了我国无病毒种薯的时代。随着植物茎尖培养脱病毒技术以及离体快繁技术日趋成熟, 20世纪90年代以来全国各地相继建立了

13、一批工厂化试管苗繁育基地,马铃薯作为重要的经济作物,其脱毒苗增产可达60%,脱毒种苗的生产也越来越知名，如百事可乐公司投资在中国农业科学院建立的脱毒种薯组培生产车间。据不完全统计,目前我国约有 2000多家组培室,在上千种植物中建立了组培再生技术，年产组培苗几亿株。这些组培厂年产种苗数千万株,极大地满足了市场的需求。植物组织培养是以植物细胞培养技术为前提的一项生物技术"，茎尖培养是通过试管培养植株茎尖的一小部分无病毒感染的分生组织细胞,进行大批量繁殖。自从1902年德国科学家哈伯兰德提出植物细胞的全能性理论后,细胞全能性研究逐渐成为生物学研究领域的热点,而建立在细胞全能性基础上的植物

14、组织培养技术从此逐渐兴起和发展。1937年前后,法国科学家高特里特和诺比考特几乎同时培养了胡萝卜根的小块组织,并使细胞增殖获得成功。美国科学家怀特用烟草的基段形成层为材料还成功地进行了组织培养和继代培养,他们的工作为植物组织和细胞培养技术的发展奠定了基础。近年来,植物组织培养技术作为一种基本的试验技术和基础的研究手段,显示出巨大的应用潜力,被广泛应用于植物学、遗传学、育种学、栽培学、解剖学、病理学等各个领域之中。20世纪30年代,经历30多年的基础研究和技术完善,50年代中期的时候，欧洲的一些马铃薯生产大国就开始了以茎尖分生组织培养法脱除马铃薯病毒为基础的无病毒种薯生产体系建设研究，保证生产种

15、薯的质量，于60年代形成产业.马铃薯脱毒及速繁技术是现代生物技术中的主要研究内容之一，也是生物技术在生产中应用最早、最广泛、效果最显著的研究成果之一。至60年代末,欧美主要马铃薯生产大国均先后成功地建立了制度化的无病毒马铃薯种薯生产体系,种薯质量因而得以改善或保障,马铃薯的单位面积产量大幅度增加。70年代末至80年代中期,这种方法逐渐为亚洲、非洲和拉美的一些国家所采用,它充分表明用茎尖分生组织培养方法脱除活体组织内病毒等病原菌，快速且大量繁殖马铃薯是可行的。由于组织培养技术日趋成熟和完善，世界各地的植物组织培养研究和应用进入迅速发展阶段，几乎所有的马铃薯生产大国都使用这项技术进行马铃薯的脱毒快

16、繁。1.4不同激素对马铃薯试管薯形成的影响植物激素是指植物体内合成，对植物生长发育产生显著作用的微量有机物，目前，主要有5种，包括生长素，赤霉素，细胞分裂素，乙烯和脱落酸，其中前三类是促进生长的物质，脱落酸是一种抑制生长的物质，乙烯是促进器官形成的物质。1.4.1 细胞分裂素对块茎形成的影响细胞分裂素以BA为主,用于离体茎尖成活和生长,其对6一BA对浓度要求严格,低浓度的6一BA对株高、茎节、茎粗均有影响,浓度高于0.2m/L以后,对试管苗生长有抑制作用,浓度加大有利于微型薯的诱导。细胞分裂素类物质对块茎形成具有促进作用，同时它也可以促进匍匐茎的形成。但宋占平5、Koda6对CTK具有促进块茎

17、形成的作用持相反观点, Ewing也报道称用BA处理叶、芽和插条推迟块茎的形成7。出现这两种情况可能是由于细胞分裂素的作用决定于与其他激素的共同作用或作用时间不同的缘故8。比如具有较高浓度的GA时,细胞分裂素促进叶枝的形成9,而且在李灿辉的试验中,在离体培养条件下, BA虽能延缓衰老,但在全黑暗条件下,却没有促进结薯的作用,同样在长日照和短日照加光间断条件下也不能诱导结薯。1.4.2脱落酸对块茎形成的影响刘梦芸认为内源ABA含量随块茎形成而增加,而且外加ABA对块茎有明显的促进作用。Wareing10(1980)也有类似报道但Qareney11却提出异议。而且也有报道称，在离体条件下, ABA

18、不能诱导匍匐枝茎段产生块茎。郭得平认为, ABA本身并不诱导块茎形成,它的主要作用是抵消GA类物质的活性。而且蒙美莲12等的试验认为ABA与GA3处于一定平衡水平,才开始形成块茎,且在块茎形成期间, ABA与GA3的比值一直较高。同时,在这一试验中,也肯定了GA3对块茎形成的抑制作用和ABA对块茎形成的促进作用,但是认为二者发生作用并没有完全的相关性。1.4.3生长素对块茎形成的影响生长素是最早发现的植物激素,但有关它在块茎形成过程中的作用和报道却很少,而且现有报道观点也不一致。李曙轩和胡云海认为IAA对块茎形成有促进作用。杜长玉13试验认为除生长素类物质是马铃薯生长发育必须的调节物质,具有延

19、长光合时间,促进根系发育,从而显著提高产量的作用。而Kumar (1974)报道称大于5um的IAA抑制块茎形成,同样也有IAA对块茎形成没有明显效果的报道15.1.4.4乙烯对块茎形成的影响关于乙烯在马铃薯块茎形成过程中的作用,有截然不同的两种观点。一方面称乙烯具有促茎块茎形成的积极作用也有乙烯抑制块茎形成的报道,并称乙烯的抑制作用主要是通过抑制细胞分裂素对亚顶端分生组织的促进作用,不利于淀粉积累所致。Vregdenhil14认为这种分歧主要来源乙烯具有匍匐茎伸长和块茎发生的双重作用,但他也认为乙烯对后者的抑制作用是很短暂的,因而可以认为乙烯是具有促进块茎形成的作用的。1.5研究的目的和意义

20、马铃薯脱毒组培苗在生产上的应用,解决了马铃薯病毒病危害造成减产的主要问题, 而试管薯的诱导在很大程度上可以较好地解决薯种退化,从而能够大幅度提高马铃薯产量和质量。通过不同培养条件及激素调控,探索脱毒组培苗培养体系及试管薯形成的最佳条件,为进一步研究马铃薯脱毒、组培快繁和培育脱毒微型种薯技术提供依据;同时,利用组培快繁技术对以上材料进行离体快繁和试管微型薯形成与发育的研究对马铃薯生产具有理论意义和广阔的应用前景,对提高马铃薯品质和产量,进行大规模微型薯种薯生产具有重要的现实意义。2材料与方法2.1 实验材料马铃薯品种：克新一号2.2 试验方法2.2.1培养基配置培养基主要以MS为基本培养基，根据

21、处理不同添加不同浓度的激素。固体培养基I配制：成品培养基粉（含有大量元素，微量元素，铁盐，有机物）+3g/L的琼脂+30g/L蔗糖，pH值调为5.8。固体培养基II配制：培养基母液（自配母液，母液，母液等）+80g/L的蔗糖+8g/L琼脂，pH值调为5.8。母液组分：硝酸铵1650mg/L,硝酸钾1900mg/L,二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L,磷酸二氢钾170mg/L母液组分：碘化钾0.83mg/L, 硼酸6.2mg/L,四水硫酸锰22.3mg/L,七水硫酸锌8.6mg/L,二水钼酸钠0.25mg/L,五水硫酸铜0.025mg/L,氯化钴0.025mg/L母液组分：乙二胺

22、四乙酸二钠37.3mg/L,七水硫酸亚铁27.8mg/L有机物组分:肌醇100mg/L,甘氨酸 2mg/L,盐酸硫胺素0.1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L2.2.2 试验处理方法试验共分以下四种处理方式：培养基I +激素ABA，然后高温湿热灭菌； 培养基I高温湿热灭菌，激素ABA过滤灭菌灭菌后加入培养基中；培养基II+激素ABA，然后高温湿热灭菌；培养基II高温湿热灭菌，激素ABA过滤灭菌灭菌后加入培养基中；高温湿热灭菌的条件为120,灭菌20min。激素ABA的浓度设置为0，0.1，0.5，1，5和10umol/L,每种浓度处理设3个重复（即接种3瓶），每瓶接种组培苗

23、10株。2.2.3 试管苗扩繁方法1：将培养所得的健壮马铃薯组培苗，剪成3cm的茎段接种到分别添加不同浓度的ABA的MS培养基中，每瓶接种10株，重复3次，进行光照培养，待幼苗生根后再进行黑暗处理，15天后观察其块茎发生情况，进行匍匐茎和块茎数的统计，20天测定地上与地下部的鲜重。方法2：将培养所得的健壮马铃薯组培苗，留有2cm根后接种到分别添加不同浓度的ABA的MS培养基中，每瓶接种10株，重复3次，进行黑暗处理，15天后观察其块茎发生情况，进行匍匐茎和块茎数的统计，20天时测定地上与地下部的鲜重。3.结果与分析3.1 不同浓度的外源ABA对试管薯结薯的影响从图1、图2可以看出，有根苗暗培条

24、件下，ABA1的块茎数量显著高于其他处理；无根苗光暗间断条件下，ABA5形成的块茎数量显著高出其他处理；说明有根、无根试管苗以及暗培、光暗间断培养等不同环境及器官条件下，外源ABA浓度对试管薯的数量有不同影响。不加入ABA或ABA10时，不利于试管薯的形成，甚至会抑制。从图3、图4可看出，有根苗暗培条件下，ABA0和ABA5处理下的匍匐茎数量显著高于其他处理；ABA0.5和ABA10形成的匍匐茎数量最少。无根苗光暗间断培养条件下，不同浓度ABA对试管苗匍匐茎数量的影响没有稳定性规律。3.2 不同外源ABA浓度对试管苗生长情况的影响从图5、图6可看出，不同浓度ABA对试管苗匍匐茎鲜重的影响规律一

25、致；随着浓度的增加匍匐茎鲜重明显降低。无根苗暗培条件下的匍匐茎鲜重高于有根苗光暗间断培养的匍匐茎鲜重，相差0.23g/瓶。从图7、图8可以看出，无根苗暗培和有根苗光暗间断培养条件下，不同ABA浓度对块茎鲜重的影响结果一致。ABA1时块茎鲜重达最大值；比对照分别大出68%和27%，并且有根苗暗培条件下的块茎鲜重明显大于无根苗光暗间断培养。ABA浓度为5和10 时块茎鲜重出现最小值，说明高浓度ABA抑制试管薯生长。表1.有根、暗培条件下不同ABA浓度对试管苗鲜重的影响（g/瓶）ABA 0ABA 0.1ABA 0.5ABA 1ABA 5ABA 10地上部0.74a0.53abc0.45c0.69ab

26、0.69ab0.45c地下部0.48ab0.38b0.34b0.55a0.38b0.28b根冠比0.650.720.760.790.550.62表2.无根、光暗间断下不同ABA浓度对试管苗鲜重的影响（g/瓶）ABA 0ABA 0.1ABA 0.5ABA 1ABA 5ABA 10地上部2.18a1.78ab0.71c1.19bc0.61c0.89bc地下部0.72a0.33b0.34b0.76a0.17c0.18c根冠比0.330.190.480.640.280.20从表1、表2可以得出，ABA0条件下的试管苗地上部分的鲜重明显大于其他处理，不加入激素明显促进地上部的营养生长。ABA1处理下的地

27、下部鲜重及根冠比显著高于其他处理，ABA5和ABA10处理下的地下部鲜重最低，说明地下部包括块茎形成和生长的最适ABA浓度为1，ABA浓度为5和10时，不利于地下部的生长。4. 结论与讨论4.1有根苗暗培与无根苗光暗间断培养条件下，不同ABA浓度对块茎数量有明显影响。暗培条件下ABA1浓度最利于试管薯数量的增加，光暗间断条件下ABA5促进试管薯数量。不同浓度ABA对匍匐茎数量的影响无稳定的规律性。4.2 不同浓度ABA对块茎鲜重和匍匐茎鲜重的影响结果一致。匍匐茎鲜重随ABA浓度增加而减少；块茎鲜重在ABA1时达到最大值；4.3培养基中不加入ABA促进试管苗地上部的生长；高浓度ABA（5或10）

28、抑制试管薯地上部和地下部的生长发育。4.4 最适马铃薯块茎形成和生长的ABA浓度为1，过大或过小都不利于试管薯的形成和试管苗的生长发育。致谢本论文是在导师贾立国老师和巴特尔老师的悉心指导下完成的。无论是从论文的选题、试验方案设计、试验的实施、论文的撰写及修改等方面,导师都倾注了大量的精力和心血。在此,我要对我的导师贾立国一年多以来对我的工作、学习和生活等方面给予的无微不至的关怀致以崇高的敬意和衷心的感谢!感谢樊明寿老师提供了这样一个科研的平台，使我顺利完成了课题的研究工作。试验的顺利完成还得益于本实验室各位同学及同班同学给予的大力支持和热心帮助,每当我在试验上遇到困难的时候,他们和我一起分析问

29、题的实质,讨论解决问题的方法,在精神和生活上无私的支持和鼓励我。在此,向曾经给予我帮助的苏亚拉其其格师姐及同班同学方梅梅、郭庆龙、孟勐等衷心地说一声感谢!感谢我的父母和朋友,每当我在生活和学业上遇到困难、挫折的时候,是他们默默的支持着我,给予我生活和工作上的理解、关怀和帮助,使我能潜心完成学业。最后,由衷的感谢所有支持、关心、帮助及鼓励过我的老师、同学、亲人及朋友们! 董艳慧2014年6月于呼和浩特参考文献1 G. Mix-Wagner. The conservation of potato cultivars. Potato Research,1999,42:427-4362 H. W. (

30、Bud) Piatt, E. S. Plissey,G. R. MacKay, et al. Sustaining potato crop, land and industry health beyond the year 2000: Current issues and future needs. American Journal of Potato Research, 2000,77(5):333-3523 王肖云，胡宗利，陈国平等.马铃薯试管薯诱导体系的优化.广东农业科学,2008 (5): 10-134 李 灿 辉 , 左 祥 . 用 颈 尖 分 生 组 织 培 养 方 法 脱 除 马

31、 铃 薯 病 原 菌 . 云 南 农 业 科技,2000,(1):147-149.5 宋占平.细胞分裂素对块茎形成的影响J.西北师范大学学报(自然科学版),1992,28(1):55-60.6 YasunoriKoda and YozoOkazawa.Detection of potato-Induction Activity in Potato Leaves and Old Tubers.Plant and Cell Physiol,1988,29(6):967-974.7 Ewing EE.In Davies PJ,plant hormones and their role in plan

32、t growth and development.MartinusNijhoffPublisbers, Netherlands,1987,515.8 牟小翎,李文金,唐丽娜等.紫色马铃薯的组织培养和快速繁殖.特色蔬菜,2007,109 郭得平.植物激素与马铃薯块茎形成.植物生理学通讯, 1991, 27 (2): 130 -133.10 Wareing PF and JermingAMV.The hormonal control of tuber ization in potato.In Plant Growth,1980.11 Kumar Dand Wareing P F.Factors c

33、ontrolling stolon development in the potato plant.New Phytol,1972,71:639-64812 蒙美莲,刘梦芸.赤霉素和脱落酸对马铃薯块茎形成的影响，马铃薯杂志,1994,8(3):134-137. 13 杜长玉.不同生长素在马铃薯上应用效果的研究.中国马铃薯,2000,14(3):137-140.14 reugdenhilD,StrickPC.An integrated view of the hormonal regulation of tuber formation in potato(Solanumtuberosum)J. Physiol Plant,1989,75:525-431.15 OkazawaY.physiological studies on the tuberization of potato plants.JFacAgric Hokkaido Univ,1976,55:267-347.16 郭予榕.生长调节剂对马铃薯某些生理特性的协同效应