抗原抗体反应实用教案

1、钩状效应(xioyng)和带现象一、定义1、钩状效应是指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性(ynxng)的现象。2、带现象:在抗原抗体反应等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反应,这种现象称为带现象3、等价带:抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带.在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。 第1页/共22页第一页，共23页。 4、前带现象:抗原抗体反应当抗体量过时,不出现可见反应。 5、后带现象:抗原抗体反应当抗原量过剩时,不出现可见反应。 1929年Heidelbe

2、rger利用等量抗体检测浓度递增抗原，当抗原浓度较低，抗体浓度相对(xingdu)较高时，沉淀反应不明显；当抗原浓度增加到与抗体浓度比例合适时，沉淀反应明显；继续增加浓度时，沉淀反应反而减弱。据此绘出双相应答曲线，曲线高峰区域，抗体、抗原浓度呈最适比，沉淀反应明显，称等价带。高峰区域左侧，由于抗体浓度过高，沉淀反应不明显，称前带；高峰区域右侧，由于抗原浓度过高，沉淀反应也不明显，称后带。抗体浓度过高所致结果称前带现象，抗原浓度过高所致结果称后带现象，统称为带现象。1977年Green把此现象称为钩状效应（hook effect），包括前后带现象。第2页/共22页第二页，共23页。HAMA反应(

3、fnyng) 自鼠单抗技术问世以来，由于其具有(jyu)对靶抗原的高亲和性和高特异性而被广泛用于临床诊断及科研，但在临床治疗中的应用受到限制。主要原因：一方面是由于鼠单抗是一种异种蛋白，反复应用会引起人抗鼠抗体反应（HAMA）；另一方面由于鼠单抗半衰期很短，很难持久疗效。第3页/共22页第三页，共23页。一、抗原抗体(kngt)反应的原理 （一）生物学定义 指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应即可在机体内进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及(yj)由亲水胶体转为疏水胶体的变化。 第4页/共22页第四页，共23

4、页。抗原抗体反应(fnyng)曲线第5页/共22页第五页，共23页。（二）抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表位)与抗体超变区的沟槽(u co)分子表面的结构互性与亲合性而结合的。1、抗原抗体的结合力抗原抗体间结合为非共价键结合，有四种分子间引力参与。(1)静电引力：是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力。这种引力的大小与两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。 第6页/共22页第六页，共23页。 (2)范登华引力(ynl)：是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引

5、力(ynl)。能促使抗原抗体相互结合，这种引力(ynl)的能量小于静电引力(ynl)。 (3)氢键结合力：是抗体上亲水基团与相应抗原彼此接近时，相互间可形成氢键，使抗原抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力(ynl)强。 (4)疏水作用力：是抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，促进其结合。疏水作用力是这些力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大。 第7页/共22页第七页，共23页。2、抗原抗体的亲合性和亲合力 亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适应而存在的引力，它是抗原抗体之间固有的结合力，可

6、用平衡常数K 来表示：K=K1/K2，K 值越大，亲合性越高；亲合性越高，与抗原结合越牢。抗体的亲合力是指抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关，即所谓(suwi)多价优势，如IgG 为两价，亲合力为单价的103倍，IgM 为510 价，亲合力为单价的107倍。由于抗原抗体的结合反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反之即容易解离。第8页/共22页第八页，共23页。 3、亲水胶体转化为疏水胶体 大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，在溶液中这些残基带有

7、电荷，由于静电作用，在蛋白质分子(fnz)周围出现了带相反电荷的电子云并形成了水化层，由于电荷的相斥，就避免了蛋白质分子(fnz)间靠拢、凝集和沉淀。当抗原抗体结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 第9页/共22页第九页，共23页。二、抗原抗体(kngt)反应的特点 抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。 （一）特异性： 是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传

8、染病的诊断与防治方面得到有效的应用。随着(su zhe)免疫学技术的发展进步，还将在医学和生物学领域得到更加深入和广泛的应用，比如肿瘤的诊断和特异性治疗等。第10页/共22页第十页，共23页。 抗原抗体的特异性是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由两者之间查问结构互补(h b)决定的。抗体分子VH 区和VL 区上各自具有的三个高变区共同组成抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补(h b)的槽沟，决定了抗体的特异性。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测相应的抗体或抗原。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原

9、表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现交叉反应。第11页/共22页第十一页，共23页。（二）比例性1、是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下，反应最彻底(chd)，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。 2、是指抗原抗体特异性结合时，生成结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见的反应。因此在进行抗原抗体试验时，抗原抗体反应比例最合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时，

10、称为后带。第12页/共22页第十二页，共23页。（三）可逆性 是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离( ji l)恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离( ji l)，解离( ji l)后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。 抗原与抗体结合形成复合物后，在一定条件下，有可以解离( ji l)为游离的抗原与抗体，这种特性称为抗原抗体反应的可逆性(renersibility)。抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形成的复合物是不牢固的，在一定条件下可以解离( ji l)，因此抗原抗体反应形成复合物的过程是一个动

11、态平衡。第13页/共22页第十三页，共23页。 抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体对应抗原的亲合力；二是环境因素对复合物的影响。高亲合力抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离；反之，低亲合力抗体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中pH过高或过低均可破坏(phui)离子间静电引力，降低抗原抗体的结合力，促使其解离。免疫技术中的亲合层析法，常用改变pH 和离子强度促使抗原抗体复合物解离，从而纯化抗原或抗体。 第14页/共22页第十四页，共23页。 此外，反应阶段性：抗原抗体反应可分为(fn wi)两个阶段。第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此

12、阶段反应快，仅须数秒至数分钟，但不出现可见反应；第二为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在环境因素(如电解质、pH、温度、补体)的影响下，进一步交联和聚集，表现凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。 实际上这两个阶段难以严格区分，所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，如反应开始时抗原抗体浓度较高，且两者比例恰当，则很快能形成可见反应。 第15页/共22页第十五页，共23页。抗原抗体反应曲线(qxin)特点：第16页/共22页第十六页，共23页。三、影响抗原(kngyun)抗体反应的因素 1、影响抗原抗体反应的因素很多，主要有两个方面：

13、一是抗原抗体本身的因素；另一方面是反应环境因素。 （1）反应物自身因素 抗原抗体反应中，抗原和抗体是反应的主体，所以它们的特性(txng)直接影响其结合情况。 抗原 抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。 第17页/共22页第十七页，共23页。 B、抗体 抗体对抗原抗体反应的影响主要有以下三个方面： (a)来源：不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。如家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价(dngji)带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价(dngji)带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。而单克隆抗体一般不用于沉

14、淀或凝集反应。 (b)浓度：抗体的浓度是相对于抗原而言的，二者浓度合适时才易出现可见的反应结果，所以在试验前应先进行预试验，滴定抗原抗体最佳反应浓度。 (c)特异性与亲合力：特异性与亲合力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确度。试验试剂应尽可能选择高特异性、高亲合力的抗体，以保证试验的可靠性。 第18页/共22页第十八页，共23页。 (2) 环境条件 A、电解质 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集

15、物的形成，常用O.85氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。 B、酸碱度 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行(jnxng)，pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质。抗原抗体反应一般在pH为69进行(jnxng)。 第19页/共22页第十九页，共23页。四、抗原(kngyun)抗体反应的类型 随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫学实验方法的基础上，新的免疫学测定方法不断出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前(mqin)根据抗原和抗体性质的不同和反应条件的差别，抗原抗体反应出现的现象和结果不同，以及反应时参与的其他条件不同，可将抗原抗体反应分为五种类型： 1、颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应(agglutination)； 第20页/共22页第二十页，共23页。2、可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应(precipitation)；3、抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应(cytolysis)，细菌抗原表现(bioxin)为溶菌反应，红细胞抗原表现(bioxin)为溶血反应；4、细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；5、免疫标记的抗原抗体反应等。第21页/共22页第二十一页，共23页。感谢您的观看(