缝隙连接蛋白在心源性猝死法医学鉴定中的应用

1、综述缝隙连接蛋白在心性猝死法医学鉴定中的应用郑凌霄，沈忆文(复旦大学上海医学院法医学系，上海200032)摘要缝隙连接(gapjunction, gj)是介导相邻细胞间离子和小分子信号物质ft接交换的跨膜通道，山 6个连接蛋口 (connexin,cx)组成的半通道相互对接而成。心性猝死发病急骤且难以预测，是法医学鉴定 工作的难点。h前研究显示，缝隙连接蛋白的改变导致gj重构可引起心脏功能紊乱，与心脏疾病的发牛 有密切关系。本文综述了目前有关心肌缝隙连接蛋白的研究进展，以期为心性猝死的法医学鉴定提供新的 研究方向。关键词缝隙连接；连接蛋白；心性猝死；综述文献类型;法医学鉴定；cx40, cx4

2、3, cx45application of connexins in medicolegal expertise of sudden cardiac deathzheng ling-xiao, shen yi-wen(department of forensic medicine, shanghai medical college of fudan university, shanghai 200032,china) abstract: gap junctions are clusters of transmembrane channels that mediate direct exchan

3、ge of ions and small signaling molecules between adjacent cells, end-to-end joint by two hemichannels which consist of 6 connexins. sudden cardiac death (scd) often occurs rapidly and unpredictable, which is still the difficult work in medicolegal expertise. studies have shown that the restructuring

4、 of gj caused by connexins will lead to cardiac dysfunctions, both of which have a close connection. this paper reviews the research progress about cardiac connexins in order to provide new guidance for medicolegal expertise in sudden cardiac death key words: gap junction; connexin; scd; medicolegal

5、 expertise; review; cx40; cx43; cx452006年，美国和欧洲心脏病协会将心性猝死(sudden cardiac death, scd)统一定义为：scd是由于 心脏原因，在急性症状发现后1小时内，意识突然丧失的自然死亡。由于其发病前缺乏明显的先兆症状和 体征，可瞬即发生心脏骤停，因此难以预测其发病。近来研究表明，scd的病种构成主要有心律失常、冠 心病、肥厚性心肌病等。2006年我国一项流行病学研究提示我国每年心性猝死的总人数约为58.6力人,且未來还可能逐年增加。scd在法保学鉴定实践中多见，但往往因为病情隐匿且发展缓慢，尸检时心脏 并无肉眼可见的病变，而h

6、分子结构和功能实际已经发牛改变，导致无法给出明确结论，给鉴定带来困难。 利用免疫组化染色和图像分析技术，国内外学者发现，缝隙连接蛋口的改变导致gj亜构可引起心脏工作 细胞损伤和传导系统功能紊乱，与心性猝死的发牛有密切关系。1 gj的结构与功能缝隙连接(gap junction, gj)(图1)是一个亲水性、低选择性、低电阻的细胞间跨膜通道，通过电 偶联和化学偶联两种方式介导细胞间电和化学信号的传递，是心肌细胞维持电生理搏动的结构基础。在众 多细胞膜通道中，gj是|=|前发现的唯一一种允许相邻细胞间直接进行物质交流的细胞膜通道铁 允许分子 量1000,直径1.0 nm的离子或小分子物质自山通过，

7、如代谢产物水分子、第二佶使、ca2+'三磷酸 肌醇、环磷酸腺昔等。gj rh相邻两个细胞膜上的缝隙连接半通道对接而成，每个半通道rh 6个结构相 同的cx形成六聚体结构，称为连接子。两个连接字相同时构成同型通道，不同时构成异型通道。cx是一 个蛋口超家族，目前在哺乳动物中发现的cx至少有21种，相对分子质暈从26000-50000不等，依分子量 的不同而分别命名为cx26、cx40、cx43、cx50等。cx具有共同的超微结构，包括4个疏水的跨膜区, 中间的亲水段形成2个胞外环和1个胞内环，而氨基末端和竣基末端均位于细胞质内。其中n末端、4个 跨膜片段和2个胞外环是相对保守的区域，而c

8、末端和胞内环部分则具有种属特异性,决定了不同的cx具半通道!有不同的生物学斗细胞1n 1 i i i » i | »连接蛋白,yyyyyyyyyyy图1缝隙连接模式图2心肌cx的正常分布和调节研究显示，cx普遍存在于心脏的工作细胞和传导系统的特化细胞中，不同心肌细胞表达不同表型的 cx,形成具有特定牛物学特性的细胞间通道。在鼠心脏中，cx43 丁心房、心室肌及传导系统远端分布丰 富；cx40强烈表达于心房肌细胞及近端传导系，而cx45分布于整个传导系统，是窦房结和房室结缝隙连 接的主要成分匚役 有报导显示cx45亦存在于心室肌细胞3但此发现尚未被其他研究证实。vozzi等3

9、 认为，人类心脏以cx40、cx43和cx45为主。cx45在成人心肌有2种分布形式:即位于心肌细胞表面和 细胞两端的闰盘处。cx45在四个心腔的心壁肌均有表达，且心房的分布多于心室。心房肌细胞cx45呈斑 点状或带状非均质分布于细胞侧面连接，心室肌细胞cx45则典型地分布于闰盘处。这种分布上的差异可 能提示成人心肌细胞的电位传导具有双向性，即在心房肌以横向传导为主，在心室肌以纵向传导为主。而 心房肌的表达多于心宗肌，可能是由于在心脏收缩的过程中，首先是心房的收缩，其次才是心宗的收缩， 这种分布形式有利于心脏的规律搏动。就心脏各腔cx45的分布比较，心室各瞬之间、心房各储之间均未 见差界，说明

10、心室各部和心房各部本身在物质和信息传递方而可能差别不大最近的研究发现，cx43不仅存在丁心肌细胞外膜，同时也存在于其线粒体的内膜和外膜上。且大多数 处于磷酸化状态。另外，对离体大鼠缺血心肌进行两个5min的缺血/再灌注的预处理后，免疫蛋口卬迹法 检测发现线粒体cx43表达增加，而细胞间闰盘的cx43并无增加问。在心肌细胞损伤、酸中毒、h浓度升 髙、细胞内ca2+浓度上升等情况时，细胞通过多种机制在数分钟内迅速改变细胞表而的通道数量，包括: 细胞内cx分子移位到闰盘处，缝隙连接内陷，通道开放的能力改变，cx合成分解的速度可能改变。3 cx与心性猝死3.1 cx与室性心律失常以往认为，心肌细胞膜离

11、子通道的紊乱是引发心律失常的最直接原因，但近i-余年来的研究提示，心 肌细胞间电偶联的改变与心律失常的发牛关系更为紧密。心律失常的发牛除与心肌细胞兴奋性异常有关 外，心脏电活动的整体性异常也是心律失常的主要机制，而电活动的异常主要由于gj通道所负责的心肌 细胞间电偶联障碍所致。cx43的正常表达和分布是心肌细胞进行正常电活动及避免心律失常的重要的保 证，通常认为cx43的减少导致传导减慢，从而使心室更易发牛折返性心律失常。心脏兴奋冲动的传导存 在各向异性，心房肌的纵向传导速度为横向传导速度的10-12倍，心室肌则约为3倍，这种传导的各向异 性主要与gj通道在心肌细胞表血的不均分布有关，心肌细胞

12、端对端连接处具有较多的gj,且血积较大， 侧对侧连接处的gj则较稀疏，面积也较小。近年的研究表明，心脏细胞间的电偶联对心脏兴奋冲动的传 导速度和传导的各向界性起着关键的决定性作用。在决定传导速度方面，gj通道其至比离子流起到了更大 的决定作用。希氏束和蒲肯野纤维具有较大的gj,每个gj所含的通道数较多，且多数通道由具有较强传 导性和较高电压敏感性的cx40构成，因此希氏束和蒲肯野纤维具有较快的传导速度。cx在心肌细胞的不均匀分布造成了电传导的不连续性利各向异性，同时也产生了心律失常的潜在危险阳。ou等冋发现6只 正常家兔的心脏左室游离壁和乳头肌cx43含量丰富均匀，细胞间的端对端连接和侧对侧连

13、接表达近似相 等；右室流出道cx43表达较左室区域少并口细胞间侧对侧连接占优势；cx43在小间层和右室流出道的左 室边分布丰富均匀，然而cx43在右室流出道间隔右室边分布减少并且有一处无cx43分布的区域；由此推 断右室流出道cx43非均匀性分布可能是原发性室性心律失常发生的基质，而缝隙连接分布的空间性和数 量的减少在致心律失常上应有协同作用。3.2 cx与心房颤动口前认为房颤是由于兴奋波在心房内不均匀地传导导致兴奋波分裂成许多折返性冲动(小波)而引起 的【叭 折返激动产生的前提是缓慢传导和单向阻滞，心房肌gj中的cx40和cx43的异常变化在促成这两 大要素上都起了重要作用。已有研究提示，心

14、肌纤维化、心房扩大、炎症及基因突变可造成缝隙连接蛋白 发生改变。gollob等在特发性房颤患者的组织标本中发现编码cxm的基因gja5发生突变，连接蛋白表 达分析显示细胞间转运受损或细胞间电偶联减少，实验结果捉示，特发性房颤可能有基因基础，gja5突 变导致特发性房颤的易感性增加。电偶联在心肌细胞z间存在各向异性，目前研究显示，cx40的下调以 及异常磷酸化可能导致异常的细胞间传导以及心房电牛理特性的改变，从而导致房颤的启动和维持。另外, 也有研究发现即使cx的表达没有改变，但空间分布的不均也为房颤的发生和维持提供了基础。因此推断, 连接蛋白的表达水平和空间分如变化对能是房颤发生的病理基础o

15、vander velden等衣山羊持续性房颤模 型中发现，cx40分布在心房呈显著异质性，表现在某些区域与相邻组织比较含量极低。使用犬、鼠模型 等类似实验也多次证实，房颤引起的cx重构是其得以维持的一个重要因素。3.3 cx与冠心病伴心肌梗死冠状动脉粥样硬化性心脏病伴心肌極死(myocardial infaiction, mi)患者极易发生室性心律失常或猝 死。目前普遍认为其发牛机制除与心肌细胞兴奋性异常有关外，电偶联障碍也是主耍原因。cx43在止常 心脏均匀分布在心室肌各层，多数研究表明mi后cx43在分布、数量等方面会发生明显异常的改变，我们 称z为cx43亜构。对犬mi模型研究发现心外膜

16、梗死边缘区存活心肌细胞的cx43发生了亜新分布，呈紊 乱散在分布丁细胞的侧对侧连接处，数量也明显减少：在距离梗死区稍远心肌，cx43的分布虽未发牛明显 异常，但平均每个细胞cx43的量较对照组减少30%(pv0. 05)o amino等血研究发现兔mi后cx43的分 布及荧光标记血积、蛋白表达水平除有上述类似的改变外，其mrna表达水平较止常对照组减少33% (p<0. 05)。这些研究均表明mi后cx43发生了重构现象，且伴有基因水平的编码下降。至于cx43重构的 机制，因发现其mrna表达水平的不同，目前尚存在争议。陈林3等利用免疫组化和图像分析技术对12例 冠心病伴心肌梗死猝死病例

17、的心肌cx43研究发现,心肌梗死病灶及其邻近区域cx43的数量和分布高度不 均一性是猝死性心律失常的结构基础，提示在诊断冠状动脉粥样硕化性心肌梗死猝死时，脱磷酸化cx43 具有重要的诊断价值。3. 4 cx与高血压研究发现，cx表达的变化和高血压有着密切的联系呦，高血压宜接诱发猝死案例报道少见，常并发 于其它严重心脏基础病变，如心肌炎、扩张性心肌病、冠心病等，对早期诊断和临床预防有指导意义。文 献报道提示，一些参数的改变，例如机械负荷、no的生物利川度、内皮细胞切应力、血管紧张素ii等可 能参与了调节cx的表达121-22lo由于实验模型、动物种属或检测方法的不同，cx在高血压发生发展中作 用

18、的研究尚存在一些争议。对口发性高血压大鼠模型研究表明，内皮细胞和平滑肌细胞cx40、cx37表达 下调，而对于cx43表达的报道不-致。应用血管紧张素转换酶抑制剂在降低血压的同时，可以恢复内皮 细胞cx的表达，间接证明了 cx与高血压z间的关系。dlugosovd等凶应用临界高血压模型和自发性高血 压模型结合免疫荧光、蛋门印迹、电镜等多种技术证明在髙血压甲期cx43表达开始下调并通过影响缝隙 连接间通讯促进高血压的发生。最新研究表明肾索分泌和cx40蛋白的表达有明显的联系嗣，利川基因工 程特异性敲除小鼠的cx40表达基因，肾素的合成和血浆水平都增加了，这可能是cx40表达缺乏使血管舒 缩发生紊

19、乱，最终导致持久、显著的血压升高，山此支持了 cx40基因多态性为高血压危险因素的结论。4结语缝隙连接蛋口的编码基因和数量变化、异质性分布及磷酸化状态均门j引起gj重构，导致心肌工作细 胞损害和传导系统功能紊乱，与心性猝死关系密切。利川免疫组化染色和图像分析技术对心脏缝隙连接蛋 口的研究为心性猝死的法医学鉴定提供了新的思路和方法，相信随着技术的发展和研究的深入，结合缝隙 连接蛋白检测对心性猝死进行法医学综合鉴定将逐步成为现实。参考文献1王红月，浦介麟.心脏性猝死的病理研究现状与展望j.中华病理学杂志，2009,38(6):425-427.l2j卢才义，高磊.老年人心脏性猝死的定义、流行病学及病

20、i大i学j.实用老年医学，2007,21:363-365.3 daniel ag david lp. gap junctions j. cold spring harb perspect biol, 2009, 1:25-76.4 alonso pm. connexin phosphorylation as a regulatory event linked to channel gating j. biochim biophys acta 2005,1711 (2): 164-171.5 laird dw. life cycle of connexins in health and dise

21、ase j. biochem j, 2006, 94(3):527-543.6 martin pe, evans wh. incorporation of connexins into plasma membranes and gap junctionsj. cardiovasc res, 2004, 62(2): 378.7 coppen sr, severs nj, gourdi rg connexin45 (alpha6) expression delineates an extended conduction system in the embryonic and mature rod

22、ent heart j. dev jenet,1999, 24(1-2):82-90.81 verheijck ee, van kempen mj, veereschild m, et id. electrophysiological features of the mouse si noatria node in relation to connexin distribution j. cardiovasc res, 2001, 52( 1):40-509 johnson cm, kanter em, green kg et al. redistribution of connexin45

23、in gap junction of connexin43-deficient heartsj.cardiovascres, 2002, 53(4):921-935.10 vbzzi c, dupont e, coppen sr, et al. chamber-related differences in connexin expression in the human heart j, mol cell cardiol, 1999, 31(5):991-1003.11 夏仲年,杨桂姣,宋慧芳等.间隙连接蛋白45在成人心肌的表达j, ill西医药杂志,2010,39(4):315.112宋波,

24、廖斌.心脏缝隙连接蛋白的研究进展j.海南医学,2010,21(3):104-106.13 梁庆,林吉进，李玉光.缝隙连接、连接蛋白43及其与心律失常的关系j,中国心血管杂志，2006, 11:59-62.14 ou b, nakagawa m, kajimoto m, et al. heterogeneous expression of connexin43 in the myocardium of rabbit right ventricular outflow tract j. life sci, 2005, 77(1):52.15 moe gk, theinboldt wc, abids

25、kov jk. computer model of atrial fibrillation j,am heart j, 1964, 67(3):200-207.16 gouob mh, jones dl. somatic mutations in the conncxin40 gene (gja5)in atrial fibrillationfjl- n engl j med,2006, 354(25):2677-2688.17 vander velden hm, van kempen mj, wijffels mc, et al. altered pattern of connexin40 distribution in persistent atrial fibrillation in the goat j. j cardiovasc electrophysiol, 1998, 9:596.18 amino m, yoshiokak k. tanable t. et al. heavy ion radiation up-regulates cx43 and ameliorates arrhythmogcnic substmtes in hearts after myocardial infarction j. cardiovasc res,