毕业设计与论文（大豆根际固氮菌筛选与鉴定）

1、齐齐哈尔大学毕业设计（论文）题 目大h根际固氮菌筛选与鉴上学 院牛:命科学与农林学院专业班级 先物技术学生姓名指导教师成 绩 自生同氮菌是指在土壤屮能够独立进行固氮的细菌。由丁培养等处理容易，在实验 室里可固定大量氮素，所以对固氮菌的研究多使用此种生物。固氮菌对人类来说有着重 要的用途，它可以提高大豆的产量，改善土壤的质量，可以用作环境改良剂，也可以作 为一种生物产品。所以越来越多的科学家开始对它进行了研究。自生固氮菌是植物根际促生细菌(pgpr)的重要组成成分，并且可以将人气中的2 通过生物固氮作用供给植物牛长，提高植物对氮素的利用。木试验从固氮菌的分离、筛 选入手，ashby无氮培养基上共

2、生长了六种菌，从这六种菌中捉取分离得到固氮菌。然 后进行革兰氏染色，选取其中长势良好的三种菌进行生理生化鉴定，根据其反应鉴定出 细菌的种类，所选择的三种菌是lln1、lln2、lln9,最终的鉴雄结杲是lln1为未知, lln 2为真细菌目，固氮菌属，敏捷固氮菌；lln 9：为真细菌目，固氮菌属，褐色固 氮菌。关键词：固氮菌；根际促生细菌；固氮酶abstractsince the birth of adopting refers to the soil on nitrogen-fixing bacteria can be independent. due to the training and

3、 easy, can be fixed in the laboratory of nitrogen, so for the use of such research colony. adopting for humans have important purpose, it can improve the soybean yield and improve the quality of the soil and can be used for environmental improver, also can be used as a biological products. so more s

4、cientists began to it are studied.the colony's plant rhizosphere grows bacteria (the) is an important component of pgpr atmosphere, and can be supplied by biological nitrogen fixation of n2 function of plant growth and improve the utilization of nitrogen plants. this test from the separation of

5、colony, screening, medium total nitrogen ashby without the growth of bacteria, six from six different extraction and separation of bacteria get colony. then select one gram stain, decent of three kinds of bacteria on physiological and biochemical reactions, according to the types of bacteria, identi

6、fied by choice of three kinds of bacteria is lln1, lln2, lln9, final appraisal result is unknown, lln1 for lln 2 for bacteria, adopting agile colony, lln 9: for bacteria, brown, adopting colony.keywords: n让ogen-fixing bacteria; pgpr; nitrogenase摘要iabstractii第1章绪论11固氮菌的简介11.2固氮菌的特性11.3固氮菌的发展21.4 固氮菌的

7、用途2141 生物肥料21.4.2生态环境改良剂21.4.3 生物产品开发31.5 固氮菌的固氮原理31.6 固氮菌的前景4第2章材料与方法62.1试验仪器62.2试验材料62.3 实验药品62.3.1 筛选培养基配方62.3.2油脂试验培养基配方62.3.3 淀粉水解试验培养基配方72.3.4 口引味试验培养基配方72.3.5伏普试验培养基配方72.3.6甲基红试验培养基配方72.3.7柠檬酸试验培养基配方72.3.8硫化氢试验培养基配方72.3.9石蕊牛奶试验培养基配方82.3.10尿素试验培养基配方82.4固氮菌的提取82.4.1制备筛选培养基82.4.2固氮菌的提取纯化及保藏82.5生

8、理生化鉴定试验92.5.1 油脂水解试验92.5.2淀粉水解试验92.5.3卩引味试验102.5.4伏普试验102.5.5 甲基红试验102.5.6柠檬酸试验102.5.7 硫化氢试验102.5.8 石蕊牛奶试验102.5.9尿素试验10第三章试验结果123固氮菌的提取结果93.2革兰氏染色103.3 生理生化鉴定103.4 细菌属的确定14结论15参考文献17致谢18第1章绪论1.1固氮菌的简介细菌的一科。菌体杆状、卵圆形或球形，无内生芽孑包，革兰氏染色阴性。严格好氧 性，有机营养型，能固定空气中的氮素。包括固氮菌属、氮单抱菌属、拜耶林克氏菌属 和徳克斯氏菌属。氮是农作物生长所必须的主要营养

9、元素。在农业生产屮，氮被视为衡量土壤养分状 况乃至土壤肥力的一个重要指标。作物侮年都要从土壤中带走大量的氮素，为补充土壤 氮素的损失，工业化学氮肥至今仍然是人类向土壤补给氮素的重要來源。虽然化学肥料 在促进作物生长、提高粮食产量屮发挥了巨大的作用，但长期过量使用化肥会产生一系 列问题，如酸沉降、水体富营养化、全球变暖、同温层臭氧耗渴、颗粒物和光化学烟雾 形成、饮水和食物中硝酸盐积累等，严重阻碍了农业的可持续发展。中国农业如何避 免垂蹈发达国家“先污染、破坏，后治理”的覆辙，是摆在我们面前的严峻课题。生物固氮可以直接将空气中的氮气直接转化为植物可利用的氨，供植物生长之需。 能进行同氮的只有原核生

10、物，现己发现有100多属中有固氮菌种。同氮微生物通常分为 三类：自生固氮微生物、联合固氮微生物和共生固氮微生物。它们都通过体内固氮酶系 统的催化來进行氮素的固定2】。生物固氮中，共生固氮菌中的根瘤菌属贡献最大，估计 它每年可为每公顷土地固氮250kg之多，其次是非豆科植物的共生固氮放线菌，再次是 各种蓝细菌，每年可为每公顷土地固定22kg氮索，最后是一些自生固氮菌。据联合国粮农组织1995年粗略估计，全球每年由生物固定的氮屋己近200万吨（和 当于0.4亿吨床素），约占全球植物需氮量的75%o因此，生物固氮在生产实际中发挥着 重要的作用。1.2固氮菌的特性在无氮培养、温度1840°c

11、时，菌株均能生长且有固氮酶活性，其最适生长及 固氮的温度为2637°c；在偏酸（ph值5.0）和偏碱（ph值8.0）的条件下，菌株均能 保持较强的生长势和较高的固氮酶活性，并能通过调节自身代谢适应环境的酸碱 变化，使培养液趋近屮性；培养液nacl浓度在0.52.5g/l、（nh4）2scu浓度在 0.050.50g/l时,菌株均能保持旺盛生长且有较高的固氮酶活性。1.3固氮菌的发展1901年，m.w.拜耶林克首先发现并描述了这类细菌，他定名的有2个种：一 是褐色固氮菌，常生存于中性或碱性的土壤中；一是活泼固氮菌，常生存于水中。 后來，各国学者相继分离出许多不同的菌株。1938年，c.

12、h维诺格拉茨基将生产 孑包囊的菌株（以褐色固氮菌为代表）归属于固氮菌属，将不产生饱囊的菌株（以 活泼固氮菌为代表）归属于氮单紀菌属。1950年，h.g德克斯提出建立拜耶林克 氏菌属，其主要特征是细胞两端有折光性颗粒（类脂质）。1960年，h.l.延森等 提岀建立徳克斯氏菌属，包拾生长在热带酸性土壤屮的种类。1.4固氮菌的用途1.4.1生物肥料目前国内外使用最多的固氮菌菌剂是固氮菌属和固氮螺菌属中的一些种，据 报道，这一类固氮菌对禾谷类作物籽粒及生物学产量有明显的作用。另外研究表 明，认为固氮菌肥料的使用效果不仅受土壤有机质、水分、通气状况及ph值和 矿物质等因索影响，还和菌肥用量、作物类型有关

13、。土壤本身是一个复杂的微生 物体系，其中的微生物类群及其产物，特别是抗菌索对固氮菌的增殖会有重耍影 响。固氮菌肥料是利用固氮微生物将大气屮的分子态氮气转化为农作物能利用的 氨，进而为其提供合成蛋白质所必需的氮素营养的肥料。微生物自生或与植物共 生，将大气屮的分子态氮气转化为农作物可吸收的氨的过程，称为生物固氮。生 物固氮是在极其温和的常温常压条件下进行的生物化学反应，不需要化肥生产中 的高温、高压和催化剂，因此，生物固氮是最便宜、最干净、效率最高的施肥过 程。固氮菌肥料是最理想的、最有发展前途的肥料。1.4.2生态环境改良剂高光智等51将自生固氮菌引入污水厂污泥和城市垃圾屮生长繁殖，结果表明固

14、 氮菌能在100%城市污泥屮生长，它们可以适应多种有机和发酵垃圾并加速其熟 化。对自生固氮菌和纤维素分解菌进行了混合培养，实验证明在混合培养条件下, 两种菌的生长及固氮作用均高于两种菌的单独培养。这一研究结果为我们将两种 菌混合接种于生活垃圾来加速它的降解提供了理论依据。1.4.3生物产品开发固氮菌科的大部分菌株能产生大量的夹膜和粘液，是微生物多糖开发的优良 资源，h前工业上已经开发利用的有棕色固氮菌产生的胞外多糖。phb是细菌 细胞内积累的一种能被微生物酶降解的高分了聚合物，是细菌细胞内的能源和碳 源物质，在医药、工业、农业上应用广泛，目前世界各国phb生产菌种主要是真 养产碱杆菌和固氮菌。

15、在形形色色的固氮菌中，名声最大的要数根瘤菌了。根瘤菌平常生活在土壤 中，以动植物残体为养料，口出口在地过着“腐生生活当土壤中有相应的豆科植 物生长时，根瘤菌便迅速向它的根部靠拢，并从根毛弯曲处进入根部。豆科植物 的根部细胞在根瘤菌的刺激下加速分裂、膨大，形成了大大小小的“瘤子”。根 瘤菌提供了理想的活动场所，同时还供应丰富的养料，让根瘤菌生长繁殖。根瘤 菌又会卖力地从空气中吸收氮气，为豆科植物制作“氮餐”，使它们枝繁叶茂， 欣欣向荣。这样，根瘤菌与豆科植物结成了共生关系，因此人们也把根瘤叫共生 固氮菌。根瘤菌生产的氮肥不仅可以满足豆科植物的需要，而 且还能分出一些来 帮助“远亲近邻”，储存一部

16、分留给“晚辈”，所以中国历来有种豆肥田的习惯。 还有一些固氮菌，比如圆褐固氮菌，它们不住在植物体内，能口己从空气中吸收 氮气，繁殖后代，死后将遗体“捐赠”给植物，使植物得到大量氮肥。这类固氮菌叫 口生固氮菌。目前固氮菌肥料的生产基本上采用液体发酵的方法。产品可分液体菌剂和固 体菌剂。从发酵罐发酵结束后及时分装即成液体菌剂，发酵好的液体再用灭菌的 草炭等载体吸附剂进行吸附即成固体菌剂。固氮菌肥料是含有大量好气性自身固 氮菌的微生物肥料。口身固氮菌不与高等植物共生，没有寄主选择，而是独立生 存于土壤屮，利用土壤屮的有机质或根系分泌的有机物作碳源来固定宇气屮的氮 素，或直接利用土壤屮的无机氮化合物。

17、同氮菌在土壤中分布很广，其分布主耍 受土壤屮有机质含量、酸碱度、土壤湿度、土壤熟化程度及速效磷、钾、钙含量 的影响。1.5固氮菌的固氮原理氮气是空气屮的主耍成分，占空气总量的五分z四。然而由j氮气分子被三 条“绳索”化学键所束缚，因此大部分植物只能“望氮兴叹”。固氮菌z所以能够 固氮，主要是由于其体内有一种具有特殊催化功能的蛋白质固氮酶的活动的结果 ，可以轻易地切断束缚氮分子的化学键，把氮分子变为能被植物消化、吸收的氮 原子。俄罗斯莫斯科大学生化物理研究所的研人员别尔佐娃经过多年探索研究， 成功地解释了固氮菌在空气中生存固氮的机理。別尔佐娃由此获得了 2002年的欧 洲科学院青年科学家奖。在儿

18、白万年前的太古时代，大气层屮没有酸，地球上生存着大量的厌氧性生 物。在地球上第一次大灾难发生后，地球表面出现了很多酸。大量厌氧性生物由 于酸的出现而消失了，但有少屋厌氧性生物由于躲藏在无酸、不透气的淤泥、沼 泽地和深层土壤中而存活至今。但也有一部分厌氧性生物如固氮菌，它适应了环 境，能够在含酸21%的人气层中存活，并从空气中吸收氮气。固氮菌缘何没有灭广，而在酸性环境屮生存了下来。别尔佐娃经过多年研究 揭示了它生存与固氮的奥秘。别尔佐娃发现，固氮菌内部酸的浓度低于外部，也 就是说，固氮菌拥有口身保护办法，它的呼吸链中有一种能够处理酸的特殊酶。 别尔佐娃推测，在固氮菌呼吸链中很活跃的、开始阶段起辅

19、助作用的特殊酶在处 理酸的过程屮起了主要作用。别尔佐娃通过实验观察确认，正是这种很活跃的酶 帮助固氮菌完成酸吸收与处理任务。在这种特殊酶的带动下，其余的酶才开始工 作、开始固氮。为了进一步验证实验结果，别尔佐娃将固氮菌中那个特殊的酶除 掉，结果发现，固氮菌立即丧失了在酸环境中固定氮的能力。固氮菌生长和固氮时要消耗较大的能量，能否高效固氮与植物的营养供应密切相 关，但高量氮肥则会抑制固氮酶的合成及其活性。因此，重纽固氮微生物的研究具有 十分重要的意义。日本率先成功地将nif同氮基因导入联合同氮微生物构建出耐热工程 菌，在同样的高钱条件下仍能保持良好的固氮能力。我国觅组联合固氮菌的研究也获 得了显

20、著进展山j1.6固氮菌的前景现在人类生产氮肥使用的是化学方法。不仅需要高温、高压等非常苛刻的条 件，而且还浪费大量原料，氮分子的有效利用率很低。固氮菌每年从空气中约固 定1.5亿吨氮肥，是全世界生产氮肥总量的几倍。所以，科学家正在认真研究固氮 酶的构成。中国科学家在本lit纪70年代仿制出与固氮酶功能和似、能够固氮的分 子。相信在不远的将来，人类一定能学会并利用固氮菌“巧施氮肥”的本领。从第一次发现内生固氮菌至今，对内生固氮菌的研究已有十几年，但还有很 多基础研究需要我们去做，各种固氮菌各自的具体作用如何，仍无法测定，多大 数量的内生固氮菌在宿主屮存在才能保证其发挥出积极的生物学作用，以及内生

21、 固氮菌与宿主z间发生生物学作用的机制如何，有待研究。内生固氮菌对作物的内环境的适应是特异的，h前只有少数几种（主要是禾木 科）作物的部分品种发现。如果将内生固氮菌导入更多的作物，对降低成本、提高 作物产量会有冃大的贡献，对减少使用化学氮肥造成的污染也具有重要的意义。 但是我们也要重视农业生产中的生态管理，因为当生态或生理环境变化时，本来 对宿主没有致病性或不表现出致病性的内生菌的病原因子可能被激发。如前面提 到的红苍白草螺菌是某些甘蔗品种的致病菌，接种高梁也可使高梁发生赤条病另 外，内生固氮菌的倒入会不会破坏植物的微生态平衡|，将内生固氮菌加入饲料 作物、瓜果、蔬菜中会不会导致人畜感染，也是

22、需要注意和探讨的问题。内生固氮菌己引起人们的普遍关注，越来越多的国家和学者投入到内生固氮 菌的研究，相信今后内生固氮菌在农业生产上将得到广泛的应用，并产生积极的 效果和带来良好的经济效益。农业环境中氮素的有效管理是农业可持续发展的一个关键因子。当前，由于 农田生态系统屮长期单一，过量偏施化学肥料特别是化学氮肥，造成土壤板结， 土壤质屋退化，农产品品质下降，肥料利用率低，环境污染等一系列负面影响。 据统计，我国化肥的当季利用率仅为30-35%, 年损失的氮量相当于1900多吨來 素，这种肥料的人量损失，不仅造成经济和能源的巨人浪费，增加农业生产成本, 还严重污染环境，己成为农业可持续发展的一个重

23、要制约因子。与施用化学肥料 相比，生物周氮毋需消耗非再生能源，固氮产物可直接为植物吸收利用，且不易 因挥发、反硝化、淋溶损失而引起农业环境的污染。统计资料表明，全球范圉内 每年输入陆地生态系统的总氮量约在两亿吨左右，其中2/3來自生物固氮。近年來, 随着全球“粮食”、“能源”危机及环境污染的口益加剧，人们越來越重视对生物 固氮的研究。第2章材料与方法2.1试验仪器培养皿、移液管（o.lml、iml、10ml）、移夜枪（0ml）、洗耳球、三角瓶（loooml、 500ml、250ml）、烧杯、药匙、胶头滴管、玻璃棒、量筒、隔水式恒温培养箱（上海跃 进医疗机械厂）、控温摇床（上海跃进医疗机械厂）、

24、万用电子炉（天津市泰斯特仪器有 限公司）、电子大平（北京赛多利仪器系统有限公司）、蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备 厂）、超净工作台（上海跃进医疗机械厂）、显微镜（重庆光学仪器厂）。2.2试验材料人豆根际土壤及人豆表层土壤o2.3试验药品2.3.1筛选培养基配方：葡萄糖10gmgso, 7h2o0.2gkh2po40.2gnacl0.2gcaso4.2h2o0.2gcacc)35.0g蒸憾水loooml琼脂20gph7.07.2将上述配好的培养基113°c灭菌30min2.3.2油脂试验培养基配方蛋白月东10g牛肉膏5gnacl5g香油或花生油5g1.6%中性红水溶液iml琼脂i5g-2

25、0g蒸馆水looomlph7.2将上述配好的培养基121£灭菌20血112.3.3淀粉水解试验培养基配方nacl可溶性淀粉5g2g蛋白腺10g牛肉膏5g蒸憎水1 oooml将上述配好的培养基121°c灭菌20min 调ph7.2,分装于三角烧瓶屮，115°c灭菌15min,取出后待冷却至55-60°c加入10%醋酸 铅水溶液（无菌的）iml,混合后灭菌试管中。2.3.4 口弭朵试验培养基配方蛋白月东10g蒸绸水1 oooml将上述配好的培养基°c灭菌20minnaclph5g7.62.3.5伏普试验培养基配方蛋刨东5gk2hpo42gph7.0

26、-7.2将上述配好的培养基12tc灭菌20min葡萄糖蒸餾水5g1 oooml2.3.6甲基红试验培养基配方蛋白月东5gk2hpo42g将上述配好的培养基12tc灭菌20min葡萄糖蒸憎水5g1 oooml2.3.7柠檬酸试验培养基配方nh4h2po4lgk2hpo4lgnacl5gmgso40.2g柠檬酸钠2g琼脂15-20g蒸憾水1 oooml1%漠香草酚蓝乙醇液10ml将上述齐成分加热溶解后，调ph值6.8。然厉加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121°c灭菌20min后制成斜面，注意配置时控制好ph,不要 过碱，黄绿色为准。2.3.8硫化氢试验培养基配

27、方ph 7.4的牛肉膏蛋白月东琼脂100ml硫代硫酸钠0.25g10%醋酸铅水溶液lml将牛肉膏蛋白月东琼脂培养基100ml加热溶解，待冷至60°c时加入硫代硫酸钠0.25g,2.3.9石蕊牛奶试验培养基配方牛奶粉looml石蕊0.075g水looomlph6.812tc 灭菌 20min2.3.10尿素试验培养基配方尿素20g琼脂15gnacl5gkh2po42g蛋门月东lg酚红0.012g蒸憎水looomlph6.8±0.2在蒸憾水looml中，加入上述所有成分（琼脂除外）。混合均匀，过滤灭菌。将琼 脂加入900ml蒸徭水中，加热煮沸，121°c灭菌15min

28、,冷却至50°c,加入灭菌好的基木 培养基，混合后，分装与灭菌的试管中，放在斜面位置上使其凝固。2.4固氮菌的提取2.4.1制备筛选培养基将固氮培养基所需药品放在电子炉上加热至融化，倒入干净的烧瓶中，用棉塞塞住 瓶口，用牛皮纸包住瓶口放入灭菌锅中113°c灭菌30mino同时将所需工具放在超净工作 台上紫外灯打开灭菌20min,灭菌结束后在超净工作台上进行倒平板，成所需的固氮培 养基。待冷却后进行接种。2.4.2固氮菌的提取纯化及保藏称取人豆根际的新鲜土样和表层土壤（对照试验）各10g,分别放入盛有90ml无 菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30min制成菌悬液，取上清

29、液在试管中作梯度 稀释。选取五个稀释度（10七10" 1010"）的菌悬液。在超净工作台上将o.lml土壤稀释液涂布于ashby无氮培养基上，28°c恒温培养4d,统计固氮菌的菌落数量及 形态特征。通过观察菌落的形态特征，统计不同土壤中口生固氮菌的种类，选取长势良好的菌 株，用牙签分别挑取不同种类的单菌落，接种到新鲜的无氮培养基上，28°c培养4d后。 如有需要可连续进行纯化。纯化的菌株在无菌条件下用接种针轻轻挑到无氮斜面培养基上继续培养4d,用祓 纸包好做好标签保存于4°c冰箱中。/1010泣样90血无菌水a10厂、e5lml9ml无苗水10

30、各9rol无菌水0. 2nl37 cb10土壤稀释步骤图1410*5 1尸3? °c 怠;:图2-12.5生理生化鉴定试验所有的细胞屮存在的生物化学反应称z为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。齐 种微生物代谢类型上有很大的羌异，如表现在对大分子糖类和蛋白质分解能力，以及分 解代谢的最终产物的不同，反映出它们具有不同的酶系。所以微生物的生理生化反应也 被作为细胞鉴定和分类的内容w木实验主要通过油脂水解试验、淀粉水解试验、石蕊牛奶试验、丿泉素试验、引味试 验、甲基红试验、伏普试验、柠檬酸盐试验、硫化氢试验来鉴定从土壤中提取出来的 能固氮的菌株，通过他们对不同试验的反应，从而鉴定菌株。2.

31、5.1油脂水解试验将融化的油脂培养基冷却至50°c左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，冷却。取新 鲜菌株接种于油脂培养基，28°c适温培养。培养id后，观察菌苔色，若出现红色斑点， 说明脂肪水解，为阳性反应。注意：1 不能使用变质油；2. 油和琼脂及水先加热；3. 调好ph后，再加入中性红；4. 分装时，需不断搅拌，使油均匀分布与培养基屮；2.5.2淀粉水解试验取新鲜菌苔接种于淀粉培养基，28°c适温培养。培养id后，在平板上滴加少量碘液, 轻轻旋转平板，使碘液均匀铺慢整个平板。若菌苔周i韦i出现无色透明圈，说明淀粉已被 水解，为阳性。透明圈的大小可以初步判断该菌水

32、解淀粉能力的强弱。出现透明圈为阳 性。2.5.3卩弭朵试验1%蛋白月东水溶液，先分装溶液达到试管的1 /3-1/4, 115°c蒸汽灭f 30mino把新 鲜的供试菌株接种于上述培养基中,37°c培养2d,分别加入3-5d乙瞇于培养物中, 摇动数次，使乙醯分散于液体中，静置3min,待乙醯上升后，沿试管壁缓缓加入2滴 “引味试剂，在乙瞇和培养物之间产生红色环状物的为阳性反应。2.5.4伏普试验将vp实验的培养液（葡萄糖蛋白）冻水溶液）分装试管，装量约为5ml, 115°c灭菌 30mino将供试菌株接种于vp培养基屮，28°c培养2d,加入510滴40%

33、 koh,然后加入等 量的5% 奈酚，用力振荡，再放入37°c温箱中保温30mino若培养物呈红色，贝u为vp 反应阳性。2.5.5甲基红试验将甲基红测试培养基（葡萄糖蛋白陈水溶液）分装试管，每管分装4-5ml, 115°c灭菌 30mino接种供试菌株于上述培养液中，每次3个重复，37°c培养2d。在培养液中加入 2d甲基红试剂，培养液变红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。2.5.6柠檬酸试验细菌在分解柠檬酸盐及培养基屮的磷酸胺后。产生碱性物质，使其ph升高，当加入 1%澳香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色转变为深蓝色。培养48h后观察柠檬酸盐培 养基上有

34、无细菌生长和是否变蓝，28°c培养2d,蓝色为阳性，绿色为阴性。2.5.7硫化氢试验将硫化氢培养基所需药品加热溶解后，调ph 6.8,然后加入指示剂，摇匀用脱脂棉 过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121 °c灭菌20min后制成斜面。28°c培养48h有黑色 硫化铅生成的为阳性，没有生成的为阴性。2.5.8石縊牛奶试验取三支牛奶石蕊培养基试管，分别进行接种，35°c培养24-48h,观察变化，石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时无色。2.5.9尿素试验取尿素培养基斜面试管，将三种菌分别进行接种，35°c培养24-48h,观察培

35、养基的 变化。尿素酶存在是为红色阳性，无尿素酶时为黄色阴性。第三章试验结果3.1固氮菌的提取结果提取过程中，在固氮培养基上共生长了6种菌。分别命名为lln1、lln2、lln4、 lln6、lln8、lln9。在固体平板培养基上，单个微生物细胞或抱子生长繁殖可以形成一个具有特定形状 的菌落。在一定的培养基上和一定培养条件下，微生物的菌落特征是稳定的，菌落的基 本特征包括菌落形状、人小、边缘、隆起度和颜色等。将分离纯化的菌株16号，在固 体平板培养基划线后，置于37°c恒温培养箱屮，培养好后，观察菌落的基本特征。实验 结果如表1。表31菌落的形态特征菌种颜色大小形状边缘干湿程度表面ll

36、n 1乳白色较小圆形整齐湿光滑突起lln2黄色较小圜形整齐较湿光滑平坦lln4乳白色较小圆形整齐湿光滑平坦lln6粉红色较小圜形整齐湿光滑突起lln8淡绿色较大圆形整齐湿光滑突起lln9白色较大不规则不整齐湿光滑突起3.2革兰氏染色对所生长的菌落提纯后进行革兰氏染色，涂片观察。进行革兰氏染色的步骤如下：（1）制片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。（2）初染：滴加草酸镀结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色l-2min后倾去染液，水洗 至流出水无色。（3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖lmin,倾去碘液水洗至 流出水无色。（4）脱色：将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白

37、色背景下用滴管流加95%乙醇脱色(一般20-30s),当流出液无色时立即用水洗去乙醇。(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸取，用番红复染液染色2min,水洗。吸去 残水晾干。(6) 镜检：油镜观察。注意：1选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。2. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。所观察到的菌株基本情况如下：表32菌株的形态特征菌种形状芽抱革兰氏染色运动型lln 1杆状有g+lln 2球状无g+lln4杆状有g+lln6杆状有g+lln8杆状无g*+lln 9杆状无g*+a + ”表示阳性反应；“一”表示阴性反应3.3生理生化鉴定结果生理生化鉴定试验是

38、从细菌对人分子淀粉、牛奶的水解悄况、脂肪的水解和分解來 索來检测其产淀粉酶、水解牛奶屮的蛋白质酪索、脂肪酸、丿求索酶的能力，并通过呵味、 甲基红、伏普等实验来检测具糖代谢能力，柠檬酸试验检测其碳源利用能力，硫化氢 试验检测细菌是否能产生含硫的有机物。将所做的9种生理生化鉴定试验所发生的反应归纳如下；试验lln 1lln2lln91油脂水解试验2淀粉水解试验+3口引味试验+4伏普试验+5卬基红试验+6柠檬酸试验+7硫化氢试验8石蕊牛奶试验产碱产酸产酸9尿素试验+表33牛理牛化试验反应表143.4细菌属的确定根据以上实验结果，对16菌株初步鉴定结杲如下：lln 1：待定；lln 2：为真细菌h，固

39、氮菌属，敏捷固氮菌；lln4：为真细菌目，芽抱杆菌属，多粘芽抱杆菌；lln6：为真细菌目，芽抱杆菌属，胶冻样芽抱杆菌;lln8：待定；lln9：为真细菌目，固氮菌属，褐色固氮菌。1、无氮培养基筛选，主耍从土壤屮分离出了具潜在同氮能力的、菌落形态不同的菌株。固氮菌的提取在二叶期、三叶期、四叶期、五叶期都进行了试验，提取的结 果都相同，共有六种菌。菌株形态上杆菌较多，菌落表面人多光滑、菌落较小、圆 形。具体情况如第三章表31、表32所示。根据生理生化鉴定结果得出lln 1：待 定；lln 2：为真细菌冃，固氮菌属，敏捷固氮菌；lln 4：为真细菌1=1,芽抱杆 菌属，多粘芽抱杆菌；lln6：为真细

40、菌廿，芽抱杆菌属，胶冻样芽抱杆菌；lln8： 待定；lln9：为真细菌目，固氮菌属，褐色固氮菌。2、才能被微生物吸收，胞外酶主要为水解酶，通过水裂解大分了物质 使其能被运输至细胞内。脂肪水解后的脂肪酸可改变培养基的ph 加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，而 lln9在生理生化鉴定油脂实验屮脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分 了物质分解后， 为较小化合物。值，使其降低，lln1、lln2、都未使培养基变色，说明三种菌都不含有脂肪酶。3、检测细胞屮的蛋白质酪素是通过石蕊牛奶试验来检测的，酪素水解氨基酸和肽 后，培养基会变得透明，在酸存在下，石蕊会变成粉红色，过量的酸

41、会引起牛奶的 固化（凝乳形成），氨基酸分解的会引起碱性反应，使石蕊变紫，此外某些细菌述 能还原石蕊，试管底部变为门色。其中lln 1使培养基变成淡紫色，lln2和lln9 变成粉红色说明三种菌都含有酪索。4、尿素试验是检测细胞能否产生尿素酶，尿素酗能分解尿素释放出氨，尿索琼脂 含有床素、葡萄糖和酚红，酚红在ph6.8时为黄色，而在培养过程中，产生的冰素 酶的细菌将分解尿素产生氨，是培养基的ph升高，在ph升至8.4时，指示剂回转 变为深粉红色。而三种菌都能将培养基变成深粉红色，说明三种菌都含有尿索酶。5、“引味试验是用来检测“引味的产生，若细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白月东屮的色 氨酸，产生眄i

42、味和丙酮酸。口引味与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰口引味。 lln 1、lln9能产生氨酸酶，lln 1不能产生。6、甲基红试验是用来细菌能否代谢糖产生酸，若能代谢糖产生酸，培养基就冋变 酸，使加入的甲基红指示剂有橙黄色转变为红色，即甲基红反应。三种菌中只有 lln1能代谢糖产生酸。7、伏普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力， 如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱竣生成乙酰i卩基乙醇，此化合物在碱性条件下能被 空气屮的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋口月东小精氨酸的呱基作用，生成红色化合物。三种菌屮只有只有lln1有这种能力。8、柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用

43、。澳香草酚蓝为指示剂，当ph改 变时会有不同的颜色变化。三种菌都能利用柠檬酸盐，使培养基由绿色变成蓝色。9、硫化氢试验是检测硫化氢的产生，有些细菌能分解含硫的有机物产生硫化氢， 硫化氢一遇培养基屮的铅盐就回形成黑色的硫化铅形成黑色的沉淀物。三种菌都不 能分解含硫的有机物。参考文献1 林凡，王正芳，宋未，等.联合固氮菌的应用效益与增产机理.中国农学通报，1998, 14(3)： 32-34.2 林敏,尤崇构.根际联合固氮作用的研究进展.植物生理学通迅，1992,28(5)：323329.3 banik s.and dey,b k.available phosphate content of an alluvial soil is influenced by inoeulation of some isolated phosphate-solubiliing mieroorganismsj.plant soil, 19