毕业论文（设计）-有机辣椒土壤微生物分离及主要真菌种类鉴定

1、附表a. 2：本科毕业论文（设计）论文（设计）题目:有机辣椒土壤微生物分离及主要农学院植物保护07植物保护070901110199真菌种类鉴定学 院: 专 业: 班 级: 学 号: 学生姓名:指导教师:（副教授）2011 年 5 月 20 0目录口录ii摘要iii关键词iiiabstract ivivkey words刖r 11. 材料与方法21. 1.试验材料21.2 试验方法31.2. 1 土壤微生物的分离 31.2.2主要真菌种类的鉴定62. 结果与分析62. 1 土壤微生物生长情况62. 1. 1每克土壤细菌数62. 1.2每克土壤真菌数82.1.3每克土壤放线菌数92. 1.4.结果

2、分析102.2主要真菌的鉴定112. 2. 1 木霉丿闰(trichodenna 112. 2. 2 曲霉属 (aspergillus) 122. 2.3 青霉属 jpenicillium) 123. 结论与i寸论133.1不同施肥处理条件下土壤中齐种微生物的变化 133.2 土壤微生物跟冇机辣椒生产的关系13参考文献14致谢15有机辣椒土壤微生物分离及主要真菌种类鉴定李伟摘要土壤微生物对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用o 土壤中微生物的数 量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。本试验在贵阳市花溪区党武乡茅草 村有机辣椒试验地采集根际土壤，采用稀释平板法分离土壤微生物，用na

3、培养基分离 细菌，用马丁培养基分离真菌，用高氏一号培养基分离放线菌。研究不同肥力条件下土 壤微生物数口的变化情况。结果表明土壤小的细菌、真菌、放线菌三种菌的菌量基本上 都随肥力梯度增加而增长。并对主要真菌种类进行初步鉴定，真菌主要鉴定了青霉属、 曲霉属、木霉属。关键词：土壤，有机辣椒，细菌，真菌，放线菌organic soil microorganism separation and main chili speciesidentification funguswei ligrade 2007, department of plant protection, guizhou universit

4、y, guiyang, 550025abstracton soil fertility and soil nutrients into the soil plays an important role. the number of microorganisms in the soil due to soil type, season, soil depth varies with the level of such. the test in guiyang city thatched village party wuxiang test to capture the organic peppe

5、r rhizosphere soil, separated by soil dilution plate method, with the na medium separation of bacteria, fungi isolated with martin medium, medium with gao one isolated actinomycetes. conditions of different soil fertility changes in the number. the results show that the soil bacteria, fungi and acti

6、nomycetes of three strains of bacteria are basically the amount of the increase with the increase of soil fertility gradient. and preliminary identification of the major fungal species, mainly identified fungi penicillium, aspergillus, trichoderma spp.冃ij s我国有机食品生产起步较晚，规模很小，而且一起步就基本上面向国际市场。1990 年浙江省

7、茶叶进出口公司第一次开发有机茶叶出口到西欧市场。目前，国家环保总局 有机食品发展中心已在全国12个省市口治区设立了有机食品开发分中心。中国有机食 品标志已在国家工商行政管理局商标局注册，对有机食品标志的使用要求也作了详细规 定叫 对于辣椒的种植技术，在国内外都有相当多的研究，但是有机辣椒种植技术现在 还很少、还不完善。在国内，很多农业科技研究人员研究辣椒虫害的无公害种植技术， 为有机辣椒种植提供了可靠的依据。有机辣椒是指辣椒产地生态环境质量符合特定的标准要求，生产过程中3年以上不 使用任何化学合成物质（肥料、农药和其他化学合成物质），按照有机食品生产规则生 产的辣椒。与其他辣椒最大的区别在于按

8、照有机生产规则，在生产过程中不使用任何 化学合成的生产资料。党武地区自然坏境优越，没有工业化的影响，并且这里的农业主 耍以传统农业为主，在农业生产过程中一般不用化学药品。党武地区的环境为有机辣椒 种植提供了基础。土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化 和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物 与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际 微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极 的作用。土壤微生物对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用，土壤中微生物 的

9、数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于 h光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm30cm的土层小菌数最 多，随土层加深，菌数减少。1. 材料与方法11 试验材料器材：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、牛角匙、ph试纸、高压蒸汽灭菌锅、 培养皿、试管、酒精灯、移液枪、木夹了、恒温箱、培养皿、打火机、试管架、棉花或 橡皮塞、天平、屯子天平、玻璃珠、无菌操作工作台等。供试培养基配方分离细菌（牛肉膏蛋白豚琼脂培养基na培养基）牛肉膏：5. og蛋白10. ognacl: 5. og水：1000mlph： 7. 2-7. 4琼脂:20. og分离真菌

10、（马丁孟加拉红-氯霉素培养基）t5）葡萄糖:10. og蛋白月东：5. 0g磷酸二氢钾（kh2po,）: l.og硫酸镁（mgs044. 7h20）： 0. 5g孟加拉红：33. 4g水：1000ml氯霉素:2. 0ml琼脂：20. 0g放线菌（淀粉硝酸钾培养基：高氏一号）5淀粉:20. 0g硝酸钾l.og：磷酸氢二钾(k2hpo4)： 0. 5g硫酸镁(mgs0t4. 7h20)： 0. 5g氯化钠：0. 5g硫酸亚铁：0. olgph： 7. 2-7. 4水：1000ml.琼脂：20. 0g1.2试验方法1.2.1 土壤微生物的分离1.2. 1. 1培养基的制备计算 根据配方计算出实验中各

11、种药品所需要的量，然后再分别称量。称量 准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸 纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅 拌全溶后稍放冷。调ph值 用ph试纸测定其ph值，并用naoh调至所需ph值，必要时用滤纸或脱 脂棉过滤。一般比耍求的ph高出02,因为高压蒸汽灭菌后，ph常降低'。分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意 分装吋避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4 左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角

12、瓶的量以三角瓶容量的一半为限。包扎 试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、 制作h期等。1.2. 1.2培养基的高压蒸汽灭菌加水于灭菌器内到规定的水平面。将需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的 固、液体培养基），用棉塞塞住，用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌 锅内的套筒屮。关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。打开放气阀，加热，热蒸汽上升, 以排除锅内冷空气，排气约5-10min,关闭放气阀。关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密 闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，直至温度表指针达到125°c时， 开始计吋，通过调节电源，维持温度在125

13、°c到135°c 30分钟时间。灭菌完毕，待压力 口然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早。打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及 培养基7 o1.2. 1.3倒平板na培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基熔化，待冷至5560°c吋，向马丁氏 培养基中加入氯霉素溶液，使每毫升培养基中含氯霉素30微克。然后分别倒平板，其 方法是右手持盛培养基的试管或三角瓶，左手拿平培养皿并松动棉塞，用小指和无名指 夹住拔出棉塞（如果试管内或三角瓶内的培养基一次可用完，棉塞可不必夹在手指上）， 试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养肌盖在火焰附近打开少许，迅速注入培养基 约15毫升左右

14、，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后 即成平板。1. 2. 1. 4 土壤样品的米集在贵阳市花溪区党武乡茅草村试验地采集冇机辣椒根际土壤，在三个肥力梯度（如表1. 1）小区分别随机采集3个点，以空地作为空白对照。采集离地面10cm深，作 物根部附近的土壤。每个刀采集土壤分离一次（如表1.2）。2009年06刀到2009年12 月试验地种植的是玉米，2010年3月到2010年8月试验地种植的是辣椒。种植玉米和 辣椒都是采用直播间苗的方式。表1.1有机辣椒地基肥处理基肥施肥时间及方式ckokg/亩种植前、条施梯度一腐熟猪粪尿:1000kg/亩种植前、条施梯度二腐熟猪粪尿：

15、2000kg/亩种植前、条施梯度二腐熟猪粪尿：3000kg/亩种植前、条施表1.2 土壤样品采集时间次数12345678910111213年月09.0609.0709.0809.09()9009.1109.1210.0310.0410.0510.0610.0710.081.2. 1.5 土壤稀释液的制备准确称取土样10g,放入装冇90ml无菌水并放冇小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手 或震荡器震荡20min,使微生物细胞分散，静置20-30s,即成10土样稀释液，再用iml 无菌吸头，吸取10"土样稀释液iml,移人装有9ml无菌水的试管中，混匀，即成10弋 稀释液，再换一只无菌吸头

16、吸取10乜稀释液1汕，移人装有9rnl无菌水的试管中，混匀， 以此类推，连续稀释至10勺。试验需要的稀释浓度，细菌：10_4gm> 10 5gm ;真 菌：10 2g/ml、10 3g/ml； 放线菌：10 2g/ml、10 3g/mll9jo1.2. 1.6分离方法及培养和计数(1) 涂布：将上述每种培养基的三个平板分别标上稀释度，然后用移液枪吸取各样品各 稀释度0.1毫升对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌l型玻璃涂抹棒在培养基表面 轻轻地涂布均匀。(2) 培养和计数：将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于25°c温室培养；牛 肉膏蛋白月东平板倒置于28c培养。培养时

17、间,细菌:l-2d;真菌：3-5d；放线：3-4do 分别记录各个平板上的单菌落数何。1.2. 1.7每克土壤中微生物个数（细菌、真菌、放线菌）通过整理计算得出每克土壤中微生物个数计算公式:每克土壤样品微生物个数二同一稀释度儿次重复的菌落平均数*稀释倍数g1.2.2主要真种类的鉴定在采用稀释平板分离真菌时，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出 的吋间的不同，分别挑去各平板上不同菌落的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离 培养，在培养数日后，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做和应记录。采用 菌丝顶端纯化法逐步纯化，对菌株编号后，转至pda斜面培养基上，于25°c -2

18、8°c培养 箱中培养5-7d,然后放入4。c冰箱保存【。从培养数口的纯化菌落上挑取菌丝并连同分生抱子制成玻片，置于光学显微镜下观 察菌丝形态、抱子梗形态、砲子形态以及产砲结构，对照有关资料（魏景超.真菌鉴 定手册13（德）唐姆茨（k. h. dornsch）,（荷兰）盖姆斯（w. games）著；韩绍英译.农业土壤真菌网、周与良，邢来君.真菌学购）确定真菌的分类学地位，直至鉴定 到属。2. 结果与分析2.1 土壤微生物生长情况2.1.1每克土壤细每克土壤细菌数基本随着肥力梯度的增加而增人。由于干旱原因，第九次（2010 年4月）的细菌数量明显减少。（如表2.1图2.1图2.2）表2.

19、1每克土壤细菌数（单位:101个/克）次数12345678910111213梯度-26.5613.8914.8926.1532.4911.6411.3511.034.2719.557.324.3637.7梯度二41.7533.7139.1536.9439.0511.4210.9615.263.0024.8369.5345.7564.4梯度三6&6563.4344.6136.1955.3817.2923.6310.7610.021&67199.4356.7975.7ck19.8414.1723.0056.340.17699.852.820.346&8462.1926.52

20、51.3每克十壤细菌数(更jooooi) f502002(航akooool) f500050次数图2.1每克土壤细菌数变化图（折线图）每克十壤细菌数梯度一 梯度二 梯度三 ck图2. 2每克土壤细菌数变化图（柱形图）112.1.2. 每克土壤真菌数每克土壤真菌数基本随着肥力梯度的增加而增大，其中第五次（2009年10月）每 克土壤中真菌数较少，可能是由于真菌分离实验中浓度处理错误。（如表2. 2图2.3图 2.4）表2.2每克土壤真菌数（单位:102个/克）次数12345678910111213梯度一8.947.4212.363.151.0611.0213.8511.416.1810.968.

21、987.8226.49梯度二13.2011.869.2610.900.6117.7525.4527.7621.2022.3712.5113.7633.61梯度三15.1216.0523.2913.545.9717.6822.6436.6345.9124.3719.7721.7143.08ck0.001.67&170.000.1714.6711.5211.029.498.3213.992.3223.65每克上壤真菌数-梯度一 亠梯度二 梯度三*ck图2. 3每克土壤真菌数变化图（折线图）每克土壤真菌数50403020jl-nfpmriiodl.梯度一梯度二梯度三 ck4567891011

22、1213次数图2.4每克土壤真菌菌数变化图（柱形图）2.1.3. 每克土壤放线菌数每克土壤放线菌数基木随着肥力梯度的增加而增大，其屮第i三次（2010年8月） 每克土壤中的放线菌数量明显偏大，可能是放线菌分离实验中处理浓度出现失误。（如表2.3图2. 5图2. 6）表2.3每克土壤放线菌数（单位:10?个/克）次数12345678910111213梯度一30.8575.930.7219.69.8116.721.0521.923.4712.8514.0588.63156.06梯度二46.3152.0442.0736.7720.2125.941&199.8241.8327.2228.848

23、5.86219.09梯度三57.9585.431.0244.6436.1110.7516.3715.7850.246.1638.8177.13251.51ck13.4951.8426.527.679.3216.0212.1916.9916.3212.176.524.857&65(wooi)j每克土壤放线菌数梯度一 亠梯度二 梯度三* cko oo 53 2321a11o o o0 5 02 11 1150o图2.5每克土壤放线菌数变化图（折线图）每克土壤放线菌数梯度一 梯度二 梯度三 ck345678910111213次数图2.6每克土壤放线菌数变化图（柱形图）2.1.4. 结果分析通

24、过上述表图可得出，土壤屮的细菌、真菌、放线菌三种菌的菌量基木上都随肥力 梯度（有机辣椒种植的基肥梯度）增加而增长，可以看出施肥量越大微生物量就越多。 英屮从图2. 2,图2.4,图2. 6中可看出第九次（2010年4月）的微生物数量减少，是 由于干旱原因，土壤中的微生物量减少，细菌量减少得最多，说明细菌比真菌和放线菌 对水分的要求更高。两年同一吋间中，第一次（2009年6月）和第十一次（2010年6月），第二次（2009年7月）和第十二次（2010年7月），第三次（2009年8月）和第 十三次（2010年8月）对比可看出，细菌、真菌和放线菌量基本上第二年都比第一年有 所增多。说明轮作可使土壤屮

25、微生物量有所增加。图2.6屮第十三次（2010年8月）放 线菌量明显偏高，可能是在放线菌分离试验中浓度处理出现错误。2. 2.主要真菌的鉴定2. 2. 1 木霉属(trichoderma)木霉属菌落表面常呈同心轮纹状，绿色，呈棉絮状或致密从束状。菌丝透明有隔， 分生砲子梗有对生或互生分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，rti小梗生出分生抱子，多个分 生抱了粘聚成球形的抱了头。（如图2.7图2. 8）图2. 7木霉的菌落平板图图2. 8木霉属的分牛砲了梗2. 2. 2 曲霉属aspergillus)曲霉属菌丝冇隔膜，有足细胞，并于足细胞上长出分生砲子梗。分生砲子梗顶端膨 大成为顶囊。顶囊表面长满一层或两

26、层辐射状小梗。最上层小梗瓶状，顶端着生成串的 球形分生砲子。（如图2.9图2. 10）图2. 9曲霉的菌落平板图图2. 10曲霉的分生砲子2. 2.3 青霉属 jpenici 11 ium)菌丝与曲霉的相似，但无足细胞。青霉的分枝砲子梗顶端不膨大，无顶囊，经多次 分枝，产生几轮对称或不对称小梗，小梗顶端产生成串的青色分生抱子。分生孑包子帚状。（如图211图2.12）图2.11青霉的菌落平板图图2. 12青霉的分生他子梗3. 结论与讨论3.1不同施肥处理条件下土壤中各种微生物的变化不同施肥处理条件下，土壤屮各种微生物存在明显差异性，总体上以细菌为主，放 线菌次z,真菌最少。土壤微生物细菌、真菌和

27、放线菌的菌量都随着土壤肥力梯度的增 高而增多。2010年4月，曲于干旱原因，十壤中的微生物量减少，细菌量减少得最多， 说明细菌比真菌和放线菌对水分的要求更高。真菌种类鉴定表明：土壤屮真菌的种类主 要为青霉属、木霉属、曲霉属。其他的一些真菌，没能鉴定出来的原因是一些真菌没 冇产砲以及个人能力冇限。3. 2 土壤微生物跟有机辣椒生产的关系微生物可以提高土壤的肥力，土壤肥力的高低与生活在其中的微生物有着密切关 系。例如：（1） 土壤中的固氮微生物，主要是固氮菌，如鬪褐固氮菌，它具有较强的固 氮能力，在固氮酶的催化作用下，直接将空气屮的氮气（n2）转化成植物可以吸收利用的 氮素。土壤屮的硝化细菌在有氧

28、气存在的条件下，通过化能合成作用，把氨气（nh3）氧 化成硝酸盐，提高土壤的肥力，同时也提高了植物对氮素的利用率。可见，这些微生物 在生态系统的氮元素的循环过程中起着极其重要的作用冏。（2）有些微生物在生命活动 中，还可以分解处于有机状态的物质或者难溶于水的无机盐，使z转化成植物可以吸收 利用的无机盐离子，提高土壤的肥力。如:磷细菌能将动植物遗体或枯枝落叶屮的含磷 有机物分解，形成植物根系容易吸收的磷酸盐。（3）分解者，营腐生生活的细菌或真菌, 口 j以把动物的遗体、排泄物或者植物的枯枝落叶中所含的冇机物，逐渐分解形成无机物, 归还到生态系统的无机环境屮，而被植物重新利用，为绿色植物补充矿物质。分解者还 能将植物的枯枝落叶分解形成腐殖质，提高土壤的肥力参考文献11王景喊我国有机食品的发展现状及意义j.渤海大学学报(哲学社会科学版),2008,(02)：12-162 刘栽超，楚晓真.有机蔬菜种植关键技术j ,.现代农业科技,2006,(10) ： 12143 .方中达植病研究方法m.北京:中国农业出版社,199&6570.14j任守运.常见微牛物的分离与鉴定j.中学牛物教学，2004,(09) :4254.5.梁晨.土壤真菌分离和计数方法的探讨(j).沈阳农业大学学报.2000 31(5) :5254郑雅楠，杨宇