(SOP-QC-003-03)_Lowry法检测蛋白质含量标准操作规程[1]

1、用心、精心、决心、匠心 Lowry法检测蛋白质含量 1. 目的：2. 保证产品蛋白质含量测定按规范进行和检定结果的准确可靠。3. 依据：4. 2005年版中华人民共和国药典（三部）。5. 试剂与水：6. 所有试剂为分析纯（AW ；水为蒸储水或超纯水。7. 器皿与耗品：8. 所有玻璃器皿为清洁级，37度烤干。9. tube、tip : 一次性使用，容量瓶，96孔酶标板，10. 仪器设备：11. 酶标仪：旋涡混匀器。12. 溶液的配置：12.1. 4%!酸钠溶液：称取 4g碳酸钠，加水90ml,搅拌，使完全溶解，并定溶至100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个星期。12.2. 0.

2、2mol/L氢氧化钠溶液：称取 0.8 g氢氧化钠，加水90ml,搅拌，使完全溶解，并定 溶至100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个星期。12.3. 0.04 mol/L硫酸铜溶液：称取1g硫酸铜（CuSO5H2O）（分析纯），加水90ml,搅拌，使 完 全溶解，并定溶至100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个星期。12.4. 0.1mol/L酒石酸钾（或0.1mol/L酒石酸钠）:称取2g酒石酸钾（或酒石酸钠）,加水90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至 100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个 星期。12.5. 碱性铜液：临用前取试剂 6.

3、1 （NaCO）和6.2 （NaOH各5 ml,试剂6.3 （硫酸铜）和 呕心沥血整理word1用心、精心、决心、匠心6.4 （酒石酸钾）各0.1 ml混匀配制而成，即用即配。12.6. 酚试剂：12.7. 商品化：注意酚需要稀释到1mol/L呕心沥血整理word2用心、精心、决心、匠心12.8. 标准品来源：12.9. 人血清白蛋白标准品 HSA（中检所）.12.10. 配制标准品标准程序：12.11. 参照蛋白国家标准品使用说明书12.12. 取人血清白蛋白（HSA 一支（21.24mg）,先用超纯水溶解，定容到一洁净的25ml容量瓶中，摇匀，取23.54ml ,再用一洁净的干燥的25ml

4、容量瓶定容，即为浓度为800ug/ml 浓度的标准品。用2ml tip管分装，250ul/支，冻干。保存于-20度12.13. 使用时，取1支冻干标准品，加入 0.5ml超纯水，配制成200ug/ml标准品备用。12.14. 标准品规格12.15. 冻干的标准品每管200ug,加入0.5ml超纯水配成200ug/ml。（每次实验需要2支）12.16. 标准品的鉴定12.17. 用原有的标准品做标准曲线，随机取三支本分装品为样品，测定样品蛋白含量，得X±SD （其中X单位为ug/ml）与RSD,当X值为98-102,且RSD®小于等于2%t,认为 该标准品的标示浓度为 200

5、ug/ml。12.18. 工作标准品的配制12.19. 取冻干标准品一支（200 ug）加入0.5ml纯化水，完全溶解，混匀，标注为200ug/ml13. 程序：13.1. 样品的处理13.1.1. 一次检测过程包括标准不能超过20个样品。若是原液或成品，每个样品需做2个或3个稀释度：V水=V原（d-1）其中V水为需要加入纯化水的体积，V原为稀释前样品的体积，d为稀释度13.1.2. 待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至1mg/ml,再稀释10倍；待测样品如为未知 呕心沥血整理word3用心、精心、决心、匠心浓度的样品，可以根据 bradford标准品颜色目测后稀释样品13.1.3. 待测样

6、品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。13.1.4. 稀释后的样品需做同样的三个反应体系。13.2. 标准曲线的制备（见6.11工作标准品的配制）答叁123456步骤生丁作琮混且涉宣1八廿400标记管号1-11 (ug2 /ml)3200416(512080工作标准品浓度（ug/ml）ug2002gl0nl景1t能力(ul )入2080200401600120一80400加入工作标准品dd HO加入量（ul ）200ul04080一120160200加入稀释后样品（ul）一20013.3.测定步骤（操作温度不能高 于室温，每2个加样时加入碱性铜液1ml混匀，室温静置10分钟加入酚试剂1ml

7、混匀，室温静置30分钟间间隔均匀，为15秒）13.4. 使用酶标板测ODa13.5. 每管样品（包括标准品）取 200ul加在酶标板上，每管做三复孔，使用酶标仪检测620nm比色波长（单波长），并计算得出蛋白浓度数值。酶标仪的使用及设置参见酶标仪使用标准操作规程14. 剩余样品处理14.1. 若为发酵样品或蛋白样品，稀释后的样品应保存于4。冰箱一天14.2. 反应后的样品测完后可以直接丢弃。15. 结果计算与分析：15.1. 结果判定标准15.2. 标准曲线的相关系数均r值（r三0.99）;若是rv0.99的话，实验需要重新做；15.3. 同一样品，同一稀释度，若是三个不同的反应体系得出结果RS住10的话，也需要重新检测。15.4. 若是样品分不同稀矛!度得出的结果RSDB 10的话，也需要重新检测。15.5. 数据的取舍标准。15.5.1. 根据最高及最低浓度标准品OD值确定检测样品OD直的有效范围。15.5.2. 用有效范围内同一样品不同稀释度所得的蛋白浓度计算它们的平均数（X）和标准差（R）作