石墨烯纳米金复合材料的无酶葡萄糖生物传感器制备

1、石墨烯纳米金复合材料的无酶葡萄糖生物传感器制备摘要htss以抗坏血酸（aa）为还原剂，通 过同步还原法制得石墨烯/纳米金复合材料。采用电化 学方法，构建了一种基于石墨烯/纳米金复合材料修饰 电极的无酶葡萄糖生物传感器。实验中，通过伏安法 考察了不同修饰电极在葡萄糖溶液中的电化学行为。 同时，探讨了溶液中0h?_?离子强度、溶解氧、扫 描初始电位及石墨焼与纳米金的比例对传感器响应特 性的影响。在优化实验条件下，采用线性扫描伏安法 检测葡萄糖的线性范围为0.120 mmol/l,检出限为 1.6x10? 5? mol/l （s/n 二3）。对 1 mmol/l 葡萄糖 平行测定10次，其相对标准偏

2、差为2.7%。实验结果 表明，此传感器具有较高的灵敏度、较好的重现性、稳 定性及抗干扰能力。本方法可用于人血清样品中葡萄 糖含量的测定，回收率为96.2%103.2%，结果令人 满意。关键词htss石墨烯；纳米金（gnps）；葡萄 糖；无酶传感器；电化学？1引言?葡萄糖的分析与检测对人体的健康及疾病的诊断、 治疗和控制有着重要意义，因此，葡萄糖传感器的研 宄始终是化学与生物传感器研宄的热点之一。在诸多 类型的葡萄糖传感器中，有关葡萄糖电化学传感器的 研究较多?1,2?。常见的葡萄糖电化学传感器主要分 为有酶和无酶两种类型。有酶传感器是基于酶对底物 的特异性识别功能，具有专一性及高度选择性。然而

3、，由于酶的活性易受到周围环境如温度、湿度及化学环 境等因素的影响?3?，且固载的酶可能会泄漏，以致 影响传感器的稳定性及使用寿命，在一定程度上限制 了该类传感器的应用范围。无酶葡萄糖传感器是一种 基于葡萄糖分子在相关催化活性材料表面的电催化氧 化信号对其进行定性及定量检测的传感装置。近年来， 一些具有催化性能的纳米材料已被广泛用于制备新型 的无酶葡萄糖传感器，此类传感器因制备简单、稳定 性好，可重复利用，价格低廉，能在无酶情况下直接 检测葡萄糖，目前己成为葡萄糖电化学传感器研宄领域的热点?4?。kumiawan等?5?研究了金纳米颗粒修饰的金电极与未修饰的金电极分别在碱性溶液中对 葡萄糖的响应

4、情况，结果表明：在相同条件下，金纳 米颗粒修饰的电极对葡萄糖的催化氧化电流高于未修 饰的金电极。俞建国等?6?采用电刻蚀法制得微镍电极，利用碱性条件下葡萄糖在该修饰电极表面的电催 化氧化性质，制备了新型抗干扰无酶葡萄糖微传感器。 目前，基于金属纳米材料与碳纳米管等碳基材料复合 物的无酶葡萄糖传感器研宄多有报道?710?。石墨 烯作为一种具有二维结构的新型碳基材料，因其具有 更大的比表面积及高电子传导能力、原料易得且价格 便宜等优点，已成为继碳纳米管后新一代的理想电极 修饰材料?11,12?。将其代替碳纳米管等材料应用到 无酶葡萄糖传感器的制备尚未见报道。？本研究结合金纳米颗粒与石墨烯的优点，通

5、过同 步还原法制得石墨烯/纳米金复合材料，再采用滴涂法 并利用nation的稳定作用将该复合材料修饰在玻碳电 极表面，研制出一种高性能的无酶葡萄糖生物传感器。 该传感器可用于对临床样品的检验，具有灵敏度高， 选择性和稳定性好等特点。2实验部分？2.1仪器与试剂？chi660d电化学工作站（上海辰华仪器公司）；电 化学测量采用三电极系统：玻碳电极（？二3 mm） 或修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极（sce）为参比 电极，铂丝电极为对电极；kq?100e型超声清洗机（昆 山市超声仪器有限公司）；bsz24s型分析天平（北京 赛多利斯仪器系统有限公司）；gl?16ii型离心机（上 海安亭科学仪器厂）

6、；5500型原子力显微镜（afm，美国安捷伦科技有限公司）。葡萄糖（上海生物工程有 限公司）；nation （5%, sigma?aldrich 公司）;纳米级 石墨粉（40 nm）,抗坏血酸（aa），尿酸（ua），氯金 酸（阿拉丁试剂公司）；实验所用试剂均为分析纯，实 验用水均为二次去离子水。？2.2石墨烯的合成？氧化石墨烯（go）的制备在hummers法?13?的基础上进行了改进。即称取1 g纳米级石墨粉和0.5 gnano?3于250ml烧杯中，在冰浴中混合并搅拌，缓慢加入23 ml h?2so?4,控制溶液温度在20 °c以下 在剧烈搅拌下加入3 g kmno?4,在冰浴中控

7、制溶液温 度低于20 °c;随后移去冰浴升温到（35±3）°c，保持反应30 min （在20 min后，液体变粘稠且有少量 气体挥发）；然后将46 ml h?20缓慢加入到粘稠组分 中，搅拌（有大量气泡产生，温度会升到98 °c）;保 持温度反应15 min,随后用温水稀释至140 ml，用3% h?2o?2还原过量的kmno?4,还原后溶液呈亮黄色。？以8000r/min离心lomin，移去上层清液，重复 3次；以4000 r/min离心5 min，取上层亮黄色氧化石 墨稀溶液；最后将氧化石墨儀还原，即得石墨爆产品， 产率约为10%。？2.3石墨烯/

8、纳米金复合材料的制备？采用同步还原法制备石墨焼/纳米金复合材料。首先将80?symbolma l5 mmol/l hauci?4•3h?2o 溶液与?20?symbolma l? 1.0 g/l go溶液混合；随后加入800?symbolma l h?2o稀释、并使之混合均匀，在超声振荡条件下加入100?symbolma l ?0.1 mol/l?抗坏血酸溶液，维持该条件反应20 min,所得混合物于室温下静置48 h。 在复合材料的制备过程中，石墨烯表面含氧官能团的 数量对其与金纳米颗粒间的连接起至关重要作 用?14?。未加入抗坏血酸前，go表面大量的含氧官 能团为au?

9、3 + ?在其表面的有效吸附提供了保证；加 入抗坏血酸后，go表面的au?3 + ?首先被还原成微 小的金核，随后逐渐形成金纳米颗粒，而g表面未 吸附有au?3 + ?的含氧官能团则直接被抗坏血酸还 原，最终得到稳定的石墨烯/纳米金复合材料。该复合 材料的原子力显微镜图像（？图1?）表明，所得的石 墨烯材料的厚度约为lnm,其上面负载纳米金颗粒的 粒径约为5nm。？ts (ht5” ss图1石墨烯/纳米金复合材料的 afm形貌图？fig. 1 afm topography of grapheme (gr) /gold nanoparticle (gnps) nanocompsites ts)2

10、.4修饰电极的制备？将玻碳电极用ai?2o?3粉在抛光布上抛光，然后 依次用蒸馏水，无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗?1 min?。洗净的电极再用二次蒸馏水冲洗，最后用n?2 吹干，备用。？实验前将电极修饰材料(石墨烯、石墨烯/纳米金 复合物)预先超声分散30min，移取5?symbolma l悬浮液滴涂于已抛光好的玻碳电 极表面，置于红外灯下干燥2 h，然后在修饰过的电极 表面滴5?symbolma l 1% nafion?乙醇溶液，置于室温下晾干，即制得相应材料修饰的玻碳电极。用伏安法测 定前，修饰电极需置于?k?3fe (cn) ?6?溶液中循环 扫描(电位扫描范围一0.60.6 v,扫描速

11、率100mv/s)， 直到获得重复性响应且氧化还原峰电位差在80 mv以内0 ?2.5实验方法？实验采用三电极体系，以naoh溶液作为支持电 解质，加入适量葡萄糖溶液，分别采用循环伏安法和 线性扫描法进行测试。电位扫描范围为一0.60.6 v (vs.sce)，扫描速率为100mv/s;电化学测量均在室 温条件下进行。除特别说明，所有测试底液均通高纯 氮气20 min除氧，并在整个实验过程中保持氮气气氛。3结果与讨论？3.1葡萄糖在不同修饰电极上的电化学行为？将制得的石墨烯/纳米金修饰电极、石墨稀修饰电 极及裸玻碳电极分别置于含0.01 mol/l葡萄糖的 naoh溶液进行循环伏安扫描，实验前

12、未通n?2除氧， 结果如图2所示。？ts (ht5” ss图2葡萄糖在石墨烯/纳米金修 饰电极(a)、石墨煤修饰电极(b)以及裸玻碳电极(c) 上的循环伏安曲线？fig. 2 cvs of glucose at gr/gnp/gce (a) , gr/gce (b) and bare gce (c) in 0.20 mol/l naoh solutionts)由图2可知，葡萄糖在裸玻碳电极及石墨烯修饰电极上均无明显电化学响应，而在石墨烯/纳米金修饰 电极上则可观察到明显的氧化还原信号。表明纳米金 颗粒在无酶葡萄糖传感器的构建中具有产生电化学氧 化还原信号的重要作用。相对于裸玻碳电极，葡萄糖 在

13、石墨焼修饰电极上具有更高的背景电流，表明石墨 烯的高电子传导能力可有效地增强修饰电极的信号强 度，进而提高传感器的灵敏度。在石墨烯/纳米金修饰 电极上，当扫描电位由一0.60 v向?0.60 v变化时？，分 别在_0.30，0.08和0.35 v处观察到3个氧化峰，其 中一0.30 v处的氧化峰归因于葡萄糖的直接电化学氧 化，0.08 v的氧化峰对应着葡萄糖氧化产物“葡萄糖 酸内醋”的进一步氧化?15，16?，表明石墨稀/纳米 金修饰电极对葡萄糖的电化学氧化具有良好的电催化 活性，0.35 v处的氧化峰对应着在碱性条件下金氧化 物的形成?5?。在电位由0.60 v向？一0.60 v反向扫 描的

14、过程中？，在一0.04 v处可观察到一个明显的氧化 峰同时该峰在一0.3 v附近还伴有一个肩峰。位于？一 0.04? v处的氧化峰是由反向扫描过程中金氧化物被 还原后，葡萄糖的二次氧化产生的?17?。考虑到实 验之前未进行通n?2除氧步骤，位于一0.3 v处的肩峰 是由于溶液中溶解氧的还原产生的?18?。介于？一 0.04? v处的氧化峰具有良好的峰形和显著的峰电流，在随后的实验中将以该氧化峰的电流强度与葡萄糖的 浓度做工作曲线对葡萄糖进行定量分析。？3.2检测条件对传感器响应特性的影响？ 3.2.1oh? ?离子强度的影响葡萄糖氧化电流的强度不仅与其自身的浓度有关，0h? ?浓度也是 重要的

15、影响因素。0h?_?的存在能够使葡萄糖分子 更容易吸附于电极表面的石墨烯/纳米金上，并降低了葡萄糖氧化的活化能?16?。本实验将10?symbolma l 1 mol/l葡萄糖标准溶液分别加入10 ml 浓度为 0.02, 0.05, 0.10, ?0.20 和 0.30 mol/l 的 naoh底液中？，用循环伏安法考察了 oh? ?浓度对 葡萄糖氧化峰电流的影响（图3）。？由图3可知，随着naoh浓度，即溶液中oh?_? 浓度的增加，葡萄糖的氧化峰电流逐渐增大，当oh? 一?浓度高于0.20 mol/l时，峰电流随底液浓度增加而 降低。因此，本实验以0.20 mol/l naoh溶液作为葡

16、萄 糖电化学检测的支持电解质。？3.2.2溶解氧对传感器的影响实验中所配制的溶液在存放过程中均会溶解一定 量的氧气，溶液中的溶解氧对测定有一定的影响。因此，本实验采用通氮气20 min除氧，然后在氮气保护 气氛下进行测定，以消除溶解氧的干扰。实验结果如 图4所示。？ts (ht5” ss图4a.修饰电极在naoh支持电 解质中未除氧(a)与除氧后(b)的循环伏安曲线；b.修饰电极在含葡萄糖的naoh溶液中未除氧(a)与除氧后(b)的循环伏安曲线？fig. 4 a. cvs of modified electrode in naoh supporting electrolyte solution

17、 without exclusion 0?2 (a) and with the exclusion of 0?2(b) ; b: cvs of modifiedelectrode in the naoh solution of glucose without exclusion 0?2 (a) and with the exclusion of o?2 (b) ts)由图4可知，向样品溶液中通氮气20 min后，修 饰电极在naoh底液中的循环伏安曲线更加平整，在 含葡萄糖的naoh底液进行循环伏安扫描时，通氮气 前位于一0.3 v处的肩峰消失，此结果进一步表明了原 一0.3 v处的肩峰与溶解

18、氧的还原有关。？3.2.3扫描初始电位对传感器的影响线性扫描伏 安法是一种常见的定量分析手段，通过线性扫描的峰 电流与标准样品的浓度之间的关系即可确定传感器的 工作曲线。在线性扫描的过程中初始电位的正确选择与否会直接影响到传感器的检测性能。本实验在0.20 mol/lnaoh溶液中加入适量葡萄糖，使其最终浓度为 0.01 mol/l,并通过线性扫描伏安法测定了不同初始电 位对葡萄糖氧化峰电流的影响，实验中扫描初始电位分别为 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 和 0.8v，扫描终 止电位为_0.6v，扫描速率100mv/s，结果如图5所示。?ts(ht5”ss图 5 a.不同初始电

19、位下 0.01 mol/l 葡萄糖在0.2 mol/l naoh溶液中的反向线性扫描伏安(lsv)曲线；b. lsv的初始电位对葡萄糖氧化峰电 流的影响？fig. 5 a. linear scanning voltammetric (lsv) curves of 0.2 mol/l naoh solution containing 0.01 mol/l glucose with different initial ?potentials? in negative scans; b. effect of initial potentials of lsv on peak ?current? of

20、 glucose oxidationts)由图5可知，随着线性扫描初始电位的正移，响 应电流呈先增大再减小的变化趋势，在扫描初始电位 为0.6 v处传感器的响应电流达到最大值，即在该初始 电位下该传感器的灵敏度最高，因此，本实验以0.6 v 作为线性扫描初始电位。？3.2.4石墨烯与纳米金的比例对传感器的影响在石墨烯/纳米金复合材料的制备过程中，固定？5 mmol/l? hauci?4•3h?2o 溶液与 1.0 g/lgo溶液的总体积为100?symbolma l，改变两者的体积比分别为1 : 9, 2 : 8, 3 : 7, 4 : 6, 5 : 5, 6 : 4、7

21、: 3, 8 : 2, 9 : 1,制得不同 石墨烯/纳米金比例的复合材料，在上述优化条件下 对?0.01mol/l?葡萄糖进行线性扫描伏安法测定，葡 萄糖氧化峰电流与 v(hauci?4•3h?2?o : v(go) 的关系见图6。ts (ht5” ss图 6hauci?4•3h?2oz go的比例与葡萄糖氧化峰电流的关系？fig. 6 relationship between the ratio of hauci?4•3h?2o and graphene oxide (go) and the peak currents of gl

22、ucose oxidationts)由图6可知，随着混合物中 hauci?4•3h?2o比例的增加，葡萄糖在修饰电极表面的氧化峰电流强度逐渐增加。当两者体积比达 到8 : 2时，峰电流达到最大值，之后呈微弱的下降趋 势。即在原料比为8 : 2时得到的复合材料修饰电极可 使传感器获得最大电流响应，故最终选用该复合材料修饰电极构建无酶葡萄糖生物传感器。？3.3线性检测范围及检出限？在上述选定的最佳实验条件下，用线性扫描伏安法测定葡萄糖的氧化峰电流与浓度之间的关系。传感 器的线性范围为0.120 mmol/l；线性回归方程为y?symbolma a） = 2.4544+0.665

23、9x （mmol/l）, 相关系数为0.9994；其检出限为1.6x10?_5?mol/l （s/n = 3），？5次平行实验的相对标准偏差（rsd）在 2%5%之间？，表明方法重现性良好。本传感器具有 较宽的线性范围和较低的检出限，其性能可与无酶葡 萄糖传感器相媲美。由于正常人体内的葡萄糖含量在3.0?8.0 mmol/l范围内？?19?，本传感器可满足人血清样品中葡萄糖含量测定的要求。曇3.4传感器的选择性？在实际样品测定时，一些葡萄糖共存物可能对测 定会产生影响。本实验对可能产生干扰的物质，如尿 酸（ua），抗坏血酸（aa）等，进行了干扰测试。据 文献21报道，健康人血清中的ua与aa的

24、含量分别 是 0.02 和?0.1 mmol/l?,在含 5 mmol/l 葡萄糖的 0.2 mol/l naoh溶液中分别加入0.2 mmol/l ua和？1.0mmol/l?aa后，葡萄糖氧化峰电流分别增加了 1.3%和2.6%,表明ua和aa的加入对葡萄糖的测定几乎 不产生影响。这主要是由于修饰电极表面的nafion膜 具有排斥中性分子和阴离子的能力，从而可以选择性 地透过某些电活性物?22?。在碱性条件下，ua和 aa均为明离子，被nation阳离子交换膜挡在传感器 外，有效阻止了 ua和aa向电极表面扩散，因而可有 效消除这些电活性物质的干扰。？3.5传感器的重复性及稳定性？在优化实

25、验条件下使用同一支修饰电极对葡萄糖 浓度为1 mmol/l的溶液重复测定10次，电流氧化峰 电流平均值为3.47?symbolma a,其相对标准偏差为2.7%。实验 后将传感器于4 °c下悬于0.2 mol/l naoh溶液中保存， 每天检测一次，10 d后电极的响应信号为初始的 87.4%。表明该传感器具有较好的稳定性。这主要是由 于石墨烯/纳米金修饰电极表面所滴涂的nafion膜可 防止电极修饰材料在溶液中脱落，进而提高了传感器 的稳定性。？3.6血清中葡萄糖的检测？分别取1.0 ml血清样品（商丘市中心医院提供），用0.2 mol/l naoh溶液稀释至10.0 ml,按上述

26、方法测定；同时，为了进一步考察此修饰电极的实用性，与 常用市售血糖检测仪进行了测试比较。结果见表1。 连续测定5次，3份样品的分析结果的rsd均小于3%， 样品加标回收率在96.2%103.2%之间，本方法13.81?a、4.3?b, 4.9?c0.50022.07?al03.2?a 27.42?a、8.0?b, 7.6?c0.5004.33?a97.6?a 317.26?az 18.2?bz 17.6?c0.50012.30?a96.2?a bhdfg 3 *2,wkzq0w a.本方法，b.罗氏卓越型血糖仪，c.强生稳豪倍优型血糖仪(a. the present method; b: by

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