水质细菌总数测定作业指导书

1、常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号： wjes/qz-0017-2003名称：水质细菌总数测定作业指导书第 1 页共 5 页1 水质 细菌总数测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义细菌总数是指1ml 水样在营养琼脂培养基中，于37培养 24 小时后，所生长细菌菌落的总数。1.2方法原理平板计数法是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。因为细菌在水中能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基或一套物理、化学条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于真正存在的活细菌的总数。1.3水环境质量标准表 1-1 细菌总数地下水质

2、量分类指标（gb/t 14848-93 ）类 别类类类类类标准值（个 /ml）100 100 100 1000 1000 表 1-2 细菌总数生活饮用水卫生标准（gb 5749-2006 ）类 别饮用水农村小型集中式供水和分散式供水标准值（个 /ml）100 500 2分析方法2.1方法名称、方法来源和适用范围方法名称：平板计数法方法来源：水和废水监测分析方法(第四版 )国家环保总局2002 年第五篇第二章 四方法适用范围：此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱解剖镜。采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm） 、刻度吸管等器皿

3、121（ 20min）高压常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号： wjes/qz-0017-2003名称：水质细菌总数测定作业指导书第 2 页共 5 页2 蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。2.3培养基营养琼脂培养基：市售营养琼脂培养基，按说明配制，装于三角烧瓶中，经121高压蒸汽灭菌15min ，经无菌性检验和标准菌株检验后，贮存于暗处备用。2.4分析步骤2.4.1 选择稀释度稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30300 之间。大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1ml，所得的菌落总数可适于计数。2.4.2 水样的稀释方法将水样用力振摇2025 次，使可能存在的细菌凝团成分散状。以无

4、菌操作方法吸取1ml 充分混匀的水样，注入盛有9ml 灭菌水的试管中，混匀成 1：100 稀释液。按同法依次稀释成1：1000、1：10000 稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。2.4.3 操作方法以无菌操作方法用1ml 灭菌吸管吸取充分混匀的水样或23 个适宜浓度的稀释水样 1ml，注入灭菌平皿中，倾注约15ml 已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注两个平皿。待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37恒温箱内培养24h，进行菌落计数。2.4.4 菌落计数培养之后，立即进行平皿菌落计

5、数。如果计数必须暂缓进行，平皿需存放于510冰箱内，且不得超过24h。但是不可以使这种做法成为常规的操作方式。作平皿菌落计数时，可用解剖镜检查，以防遗漏，在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数。在求同稀释度的平均数时，如果其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用， 而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2 代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。如果由于稀释等过程中有杂菌污染，或者对照平皿显示出培养基或其他材料染有杂菌，以致平皿无法计数，则应报告“实验事故”。对那些看来相似，距离相近但

6、是却不相触的菌落，只要它们之间的距离不小于最小菌落的直径，便应一一予以计数。那些紧密接触而外观（例如形态或颜色）相异的菌落，也应该一一予以计数。2.4.5 计算细菌总数是以每个平皿菌落的总数或平均数（例如同一稀释度两个重复平皿的平均数）乘以稀释倍数而得来的。各种不同情况的计算方法如下：常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号： wjes/qz-0017-2003名称：水质细菌总数测定作业指导书第 3 页共 5 页3 首先选择平均菌落在30300 之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告（见表3 例 1） 。若有两个稀释度，其平均菌落数均在303

7、00 之间，则应该按二者之比值来决定。若其比值小于2 应报告两者的平均数，若大于 2 则报告其中较小的数值（见表 3 例 2、 例 3） 。若所有的稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表3 例 4） 。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表3 例 5） 。若所有稀释度的平均菌落数均不在30300 之间，则以最接近300 或 30 的平均菌落数乘稀释倍数报告（见表3 例 6） 。表 3 稀释度选择及菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个 /ml）报告方式（个 /ml

8、 ）备注10-1 10-210-31 1365 164 20 16400 16000 或 1.6104 两位以后的数字采取四舍六入五单双的原则取舍2 2760 295 46 1.6 37750 38000 或 3.81043 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.71044 无法计数1650 513 513000 510000 或 5.11055 27 11 5 270 270 或 2.71026 无法计数305 12 30500 31000 或 3.11043质量控制要求3.1对照控制采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重

9、新检验；每次检验时，另用两个平皿只倾注营养琼脂培养基，并且打开平皿10min作实验室对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程实验环境无菌性失控，应重新检验3.2精确度同一实验人员所作前15 个阳性水样平行双样结果为x1i、 x2i（x1i、 x2i 0， i1， 2， , ，15） ，则精确度判断值r27. 3。（，iiixxr21loglog）当分析所得21loglogxxrr27. 3表示精密度已失控；否则平行双样的差距可以接受。3.3最佳计数量细菌总数的测定无标准物质可用，为提高检验分析的准确性，除要尽量消除系统误差、15115/ )(iirr常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号：

10、 wjes/qz-0017-2003名称：水质细菌总数测定作业指导书第 4 页共 5 页4 人为误差的影响外，还应尽量降低随机误差的影响。增加计数量可减少随机误差的影响，考虑到工作量等因素，细菌总数测定每一平皿的最佳菌落数为30 300 个，因此， 应尽量选取菌落数在这一范围的平皿计数。4数据处理4.1数据审核分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。4.2数据填报菌落计数报告时， 菌落数在100 以内按实有数据报告； 大于 100 采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10 的指数形式表示（如报告16，000 或 1

11、.6104） 。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。5样品采集5.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；5.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500ml 采样瓶中加入0.3ml10% 硫代硫酸钠溶液；5.3 样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500ml 采样瓶中加入1.0ml15% 乙二胺四乙酸二钠（edta-na2）溶液；5.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；5.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；5.6 采样后，样品应2 小时内检验，否则，应10以下保存且不超过6 小时。6期间核查6.1人员素质首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。6.2仪器设备臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。7分析环境条件控制7.1仪器设备保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。7.2无菌室定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足