荧光定量PCR的流程原理分析与应用PPT课件

1、荧光定量荧光定量 PCR PCR 的流程，原理，分析与应用的流程，原理，分析与应用蔡振荣蔡振荣罗氏诊断产品（上海）有限公司罗氏诊断产品（上海）有限公司荧光定量荧光定量 PCR PCR 基于 PCR 技术 扩增的同时对目标基因定量 英文别名： Real-time PCR Quantitative PCR Kinetic PCR总览总览 荧光定量荧光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程 手动与自动核酸提取 逆转录 荧光定量 PCR 荧光定量荧光定量 PCR PCR 的原理的原理 检测方法检测方法 SYBR Green I, TaqMan Probes,. 分析分析 绝对定量 Absolute

2、 Quantification 相对定量 Relative Quantification 罗氏荧光定量产品介绍罗氏荧光定量产品介绍完整的流程完整的流程样品制备 核酸分离 逆转录 扩增 检测完整的流程完整的流程 核酸纯化核酸纯化 High Pure 硅吸附技术 核酸在接合液 (Binding Buffer) 环境下会吸附在硅材料表面。RNA PurificationRNA PurificationHigh Pure RNA Isolation KitHigh Pure RNA Tissue KitHigh Pure FFPE RNA Micro KitHigh Pure RNA Paraffin

3、 KitHigh Pure Viral RNA KitHigh Pure miRNA Isolation KitDNA PurificationDNA PurificationHigh Pure PCR Template Preparation KitHigh Pure Viral Nucleic Acid KitHigh Pure Viral Nucleic Acid Large Volume KitHigh Pure 16 System Viral Nucleic Acid Kit完整的流程完整的流程 自动核酸纯化自动核酸纯化 MagNa Pure LC2.0 MagNa Pure Com

4、pact MagNa Pure 96 优点： 高通量 处理各种来源的样品及各种核酸 快速的分离，简单设置，全过程小于1小时完整的流程完整的流程 RT-PCR RT-PCR Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit 反转录全长cDNA至14kb 检测低至 100pg RNA (10pg for High Fidelity) 在55oC有效的反转录正常及高GC含量的 RNA 具有RNase H活性 其他产品: 1st Strand cDNA Synthesis K

5、it for RT-PCR (AMV) cDNA Synthesis System LightCycler RNA Pre-Amplification Kit完整的流程完整的流程RNA PurificationRNA PurificationHigh Pure RNA Isolation KitHigh Pure RNA Tissue KitHigh Pure FFPE RNA Micro KitHigh Pure RNA Paraffin KitHigh Pure Viral RNA KitHigh Pure miRNA Isolation KitTriPure RNA Isolation

6、KitmRNA Capture KitmRNA Isolation KitmRNA Isolation Kit for Blood/Bone MarrowDNA PurificationDNA PurificationHigh Pure PCR Template Preparation KitDNA Isolation Kit for Cells and TissuesDNA Isolation Kit for Mammalian BloodHigh Pure Viral Nucleic Acid KitHigh Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit

7、High Pure 16 System Viral Nucleic Acid KitRT-PCRRT-PCRTranscriptor 1st Strand cDNA Synthesis KitTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV)cDNA Synthesis SystemLightCycler RNA Pre-Amplification Kit总览总览 定量定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程 手动与自动核酸提取 逆转录 荧光定量 PCR 荧光定

8、量荧光定量 PCR PCR 的原理的原理 PCR 的原理 荧光定量 PCR 与常规 PCR 的比较 检测方法检测方法 分析分析 罗氏荧光定量产品介绍罗氏荧光定量产品介绍实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCRPCR原理定义原理定义+ 扩增曲线扩增曲线+ 荧光阈值荧光阈值+ Ct值值荧光定量荧光定量PCRPCR原理常用名词概念原理常用

9、名词概念Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCRPCR原理扩增曲线原理扩增曲线Cycle（循环（循环数）数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量荧光定量PCRPCR原理荧光阈值原理荧光阈值平台期平台期C

10、t值的定义：值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value 荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值值横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点：值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性CtCt值的重现性值的重现性理想的PCR反应XnX0 2n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值定

11、量的数学原理值定量的数学原理非理想的PCR反应XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数En：扩增效率：扩增效率荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）整理方程式（2）：Log

12、2X0 Log 2M Ct Log2（1En）荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No template controlNo template control确认确认标准曲线斜率标准曲线斜率:

13、-3 : -3 -3.5 -3.535Cycles35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩内无非特异性产物扩增增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量荧光定量PCRPCR反应性的确认反应性的确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.2总览总览 定量定量PCRPCR的完整流程的完整流程 荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理 检测方法检测方法

14、 荧光染料： SYBR Green I ResoLight 探针： TaqMan Probes 分析分析 罗氏荧光定量产品介绍罗氏荧光定量产品介绍检测方法检测方法 荧光染料荧光染料 SYBR Green ISYBR Green I 不依赖于序列 不饱和不饱和 dsDNA 结合染料 激发: 488nm; 发射: 533nm 在扩增循环（延伸）和熔解曲线过程中检测AnnealingElongationEnd of Elongation 退火延伸结束时延伸检测方法检测方法 荧光染料荧光染料 ResoLight 不依赖于序列 饱和饱和的 dsDNA 结合染料 激发: 488nm, 发射: 533nm

15、在熔解曲线过程中检测SYBR Green ISYBR Green I峰形不够敏锐不能区分纯合子与杂合子序列Saturating dyesSaturating dyes均一的，敏锐的峰形只有序列的差别造成峰位变化，染料本身不影响峰位纯合子 homoduplexes杂合子 heteroduplexesV VS Svsvs检测方法检测方法 探针探针 水解探针水解探针 (Hydrolysis Probes): (Hydrolysis Probes): TaqMan Probes, Universal ProbeLibrary Probes 荧光素与淬灭剂 聚合酶的 5 核酸酶活性将荧光素从探针上释放

16、在扩增循环（延伸）中检测信号延伸结束延伸变性退火Example: FAMExc. 465nmEmi. 510nm淬灭剂淬灭剂检测检测总览总览荧光定量荧光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程荧光定量荧光定量 PCR PCR 的原理的原理检测方法检测方法 SYBR Green I, ResoLight, TaqMan Probes, HybProbes 分析分析 定性分析 判断目的基因是否存在 Tm 值 定量分析 绝对定量 Absolute Quantification 相对定量 Relative Quantification 罗氏荧光定量产品介绍罗氏荧光定量产品介绍分析分析 总览总览扩增分

17、析扩增分析定性检测定量检测熔解曲线分析熔解曲线分析产物鉴定突变检测基因扫描Dye 1Dye 1Dye 2Dye 2终点检测终点检测 (Endpoint) (Endpoint)基因分型 (Genotyping)定性检测定性检测 确定目的基因是否存在 结果以“是/否”给出 需要设定阳性及阴性对照 SYBR Green I 染料 在扩增循环中检测使用熔解曲线的使用熔解曲线的 Tm Calling Tm Calling 熔解曲线 Tm: 有50% DNA 发生熔解的温度 熔解曲线的用途: Tm calling 目的基因的确认 判断是否有引物二具体的存在融解曲线分析，单一融解曲线分析，单一峰无非特异性荧

18、光峰无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准性荧光，因此定量不准确确SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲线融解曲线定量实验的原理定量实验的原理目标基因拷贝数很多 荧光值开始增加较早Cp值小绝对定量绝对定量 用于鉴定病原体或所研究基因的存在与否 用于检测病原体基因的拷贝数或浓度绝对定量绝对定量 未知样本的浓度由标准曲线得出CyclesFluorescence标准品标准品FluorescenceTarget未知样品未知样品CyclesCrossing PointLog Conce

19、ntration标准曲线标准曲线结果结果绝对数值 (e.g. 拷贝数)相对定量的必要性相对定量的必要性相对定量相对定量 原理：比较同一样品中不同基因的表达量 用于检测复杂实验处理中细微的基因表达的变化 用于长期实验及不同实验体系中所得数据的比较 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几

20、要素相对定量分析几要素相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选P P P P P P O O 双标准曲线法双标准曲线法 2 -Ct法法 相对定量分析相对定量分析两种常用的分析方法两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。计算公式求得相对值即为相对表达量。 相对值相对值= =校正值校正值= =目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析相对定量

21、分析双标准曲线法双标准曲线法公式：公式：优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一一相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待测样品待测样品1

22、18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874实验数据实验数据相对定量相对定量 Step 1: 计算出同一样品中目的基因和参考基因的Cp值 Step 2: 最终结果用目的基因的浓度比上参考基因浓度结果表达为目标基因浓度与参比基因浓度的比值相对定量相对定量 参考基因 “看家”基因 Housekeeping genes: 编码有基础细胞功能的蛋白质使用标准曲线的相对定量使用标准曲线的相对定量使用校准品的相对定量使用校准品的相对定量 校准品 Cal

23、ibrator 提供几次实验中的校准点，校正不同次实验间以及不同批号间的差异 校正目的基因和参考基因的检测灵敏度的区别，已经长期实验中的间次差别 校准品可以是： 没有处理的样品 在处理前时刻的样品 (at time 0) 正常的组织荧光定量荧光定量 PCR PCR 的完整流程的完整流程荧光定量荧光定量 PCR PCR 的原理的原理检测方法检测方法 SYBR Green I, ResoLight, TaqMan Probes, HybProbes 分析分析 定性分析 判断目的基因是否存在 Tm 值 定量分析 绝对定量 Absolute Quantification 相对定量 Relative Quantification 罗