NETs的形成对铜绿假单胞菌性角膜炎进展和预后影响的研究

1、NETS的形成对铜绿假单胞菌性角膜炎进展和预后影响的研究研究背景 : 细菌性角膜炎是临床最常见的致盲性角膜病变之一 , 如果治疗不 及时往往会导致不同程度的角膜疤痕 , 甚至角膜穿孔和眼球丧失。铜绿假单胞菌 是细菌性角膜炎的主要病原菌。由于该病原菌具有高细菌毒力 , 临床表现为发病急、进展快, 短期内导致角膜 穿孔, 因此早期干预和有效治疗对改善铜绿假单胞菌性角膜炎的预后具有重要的 临床意义。为了改善铜绿假单胞菌性角膜炎的预后 , 相关抗炎杀菌的基础研究显 得尤为重要。中性粒细胞是感染性角膜炎中重要的炎症细胞 , 它能直接吞噬细菌 , 产生活 性氧物质(ROS)和脱颗粒释放炎性因子引起大量细胞

2、聚集放大炎症反应以杀伤病 原体。中性粒细胞胞外陷阱 (neutrophil extracellular trapS,NETS) 是最新发 现的中性粒细胞抗感染机制。当中性粒细胞被病原菌刺激活化后 , 它主动向细胞外释放由染色质、 NE、MPO 颗粒组成的混合物，形成网状结构即为NETS,诱捕并杀死病原体，这一过程称之 为NETosis。目前NETS已被证实在真菌和金黄色葡萄球菌感染角膜时起杀菌作 用, 但对铜绿假单胞菌感染的报道较少。此外,NETs持续存在会损伤组织,及时清除NETS能减轻组织损伤。本实验主 要研究铜绿假单胞菌性角膜炎中 NETS是否参与杀菌过程，以及NETS的形成对铜 绿假单

3、胞菌性角膜炎进展和预后的影响。研究目的:研究铜绿假单胞菌性角膜炎中性粒细胞胞外陷阱的杀菌作用 ,探 讨药物干预NETS形成对角膜炎的进展和预后的影响。研究方法：选择68周龄 的 C57BL/6 小鼠 , 随机分成损伤对照组和角膜炎组。角膜炎组包括妥布霉素地塞米松组 （以下简称妥地组 ） 、妥布霉素组和生理盐 水组。损伤对照组刮去角膜上皮后接种灭菌生理盐水 , 角膜炎组采用改良型角膜 表面镜片法建立小鼠细菌性角膜炎模型 , 接种的铜绿假单胞菌菌液浓度为 106CFU。各组模型建立后 , 损伤对照组不滴用任何滴眼液 ,角膜炎组分别接受妥布霉 素地塞米松滴眼液 （妥地组） 、妥布霉素滴眼液 （妥布霉

4、素组）和灭菌生理盐水 （生 理盐水组 ）, 点眼次数均为 1 滴/ 次,3 次/ 日,分别于第 1、3、5、7、10天行裂隙 灯检查、采集眼前段照片并记录临床评分和角膜穿孔例数 , 观察持续直至小鼠角 膜炎完全愈合 ; 在病程的不同时期取角膜组织切片和溃疡灶刮片进行免疫荧光染 色观察中性粒细胞和NETS的变化;普通HE染色观察感染角膜炎症反应和炎症细 胞浸润情况；扫描电镜下观察NETS微观形态变化；角膜组织细菌负荷量检测杀菌 效率。所有数据均采用 SPSS 24.0统计软件进行统计 , 各组组间比较采用方差分 析,用 GraphPad PriSm 6 绘制图形。p&lt；0.05 为差

5、异有统计学意义。结果 :1. 小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎自然 病程第1天,大量中性粒细胞迅速浸润角膜组织,可见NETS形成。第3天炎症最重，中性粒细胞浸润增加，释放了大量NETS第7天炎症开始 缓慢减轻，角膜内的中性粒细胞和NETS相应减少。损伤对照组第1天少量中性粒细胞浸润角膜，但未见NETS形成,第3天已无 中性粒细胞浸润。 2.损伤对照组第 1 天角膜上皮缺损 ,表面粗糙,至第3天角膜上 皮愈合 , 角膜透明。角膜炎组第 1 天表现为角膜雾状混浊伴水肿 , 炎症细胞浸润 , 三组间表现基 本一致。药物治疗后三组差别明显 ,妥地组角膜炎症角膜损伤最轻 ,恢复最快,预 后最佳,主要表现 : 第

6、 3 天角膜混灰色混浊 , 各层结构轻度紊乱 , 炎症细胞浸润少。扫描电镜下见NETS少且结构稀疏。第5天和第3天比较无明显变化。第7天炎症开始减轻，仍可见NETS第10天角膜上皮愈合，各层结构整齐， 未见NETS,至第20天角膜炎完全愈合。生理盐水组角膜损伤重 ,恢复慢,预后差,主要表现:第3天角膜致密混浊伴 高度水肿 , 角膜明显溶解 , 大量炎症细胞浸润角膜全层 , 各层结构紊乱。扫描电镜 下见大量NETS形成。第5天和第 3天比较无明显变化。第 7天炎症开始减轻 ,但仍见大量中性粒 细胞及致密的 NETS。第10天仍可见NETS,至第30天完全愈合。妥布霉素组介于前两组之间，至 第 2

7、4 天完全愈合。发病第 3、5、7、10天, 同时期生理盐水组总分 > 妥布霉素组 > 妥地组, 生理盐水组和妥地组之间差异有统计学意义 (FD3=4.35,PD3=0.04,FD5=6.81,PD5=0.02,FD7=6.17,PD7=0.02,FD10=17.60,PD1 0=0.002), 生理盐水组和妥布霉素组分别在第 3 天和第 7 天的差异有统计学意义 (FD3=4.95,PD3=0.03,FD7=5.07,PD7=0.04), 妥地组和妥布霉素组之间差异无统 计学意义 (p>0.05) 。 3.细菌负荷量结果显示在药物治疗后第1、3天角膜

8、炎各组细菌浓度差异无统计学意义。第7天妥地组和妥布霉素细菌量较少 ,至第10天两组无细菌生长 ,而生理盐 水组仍有细菌生长(F2D7=39.16,P2D7=0.003,F3D7=87.63,P3D7=0.001,FD10=21.00,PD10=0.002) 。 同时期妥地组与妥布霉素组的细菌量无明显差异 (p>0.05) 。4.妥地组有 2 例小鼠发生角膜穿孔 ,妥布霉素组 3 例, 生理盐水组 12 例。妥 地组、妥布霉素组和生理盐水组之间差异均有统计学意义 (F4=8.88,P4=0.004,F5=6.65,P5=0.01), 妥地组和妥布霉素组之间差异无统计学 意义 (p>0.05)