enzyme酶的基础知识

1、1会计学enzyme酶的基础知识酶的基础知识二、二、 酶的化学本质酶的化学本质（一）大多数酶是蛋白质（一）大多数酶是蛋白质 1926年年J.B.Sumner首次从刀豆制备出首次从刀豆制备出脲酶脲酶结结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。质的观点。 1982年年T.Cech发现了第发现了第1个有催化活性的天然个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后（核酶），以后Altman和和Pace等又陆续发现了真正的等又陆续发现了真正的RNA催化剂。催化剂。（二）核酶（二）核酶 核酶的核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，发现不仅表明酶

2、不一定都是蛋白质， 还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。步探讨。（三）抗体酶（三）抗体酶 抗体是免疫球蛋白。具有酶催化活性的抗体是免疫球蛋白。具有酶催化活性的抗体称为抗体称为抗体酶抗体酶（abzyme）三、酶的组成三、酶的组成1. 酶酶单体酶单体酶结合酶结合酶（全酶全酶）= 酶蛋白 + 辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶 ：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基：与酶蛋白共价结合的辅酶或金属离子。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。2.（几个术语）单体酶、寡聚酶和多酶复（几个术语）单体酶、寡聚

3、酶和多酶复合物合物Proteoenzyme蛋白酶蛋白酶Holoenzyme全酶全酶单体酶（单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。寡聚酶寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。EEE碱性EEE+EE+脲多酶复合物多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。3. 活性部位和必需

4、基团活性部位和必需基团必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质4.2 酶的分类与命名酶的分类与命名1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1. 氧化还原酶类氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶

5、）（2）氧化酶类）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN）催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH + O2 + 还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子（又称羟化酶羟化酶）2. 转移酶类转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。AX + BA +BX根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮

6、基、含磷基和含硫基的酶。3. 水解酶类水解酶类：催化加水分解作用。AB + H2OAOH + BH4. 裂解酶类：裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。CH3C=OCOOHCC键CH3C=OH+ CO2CO键CH2COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+ H2OCN键COOHCHNH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+ NH35. 异构酶异构酶：催化 各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类变位酶类。6. 合成酶类合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。A + B + ATPAB + A

7、DP +Pi乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号NameType of reaction catalyzed ExampleOxido-reductasesTransfer of electronsA- + B A + B-Alcohol dehydrogenaseTransfer-asesTransfer of functional groupsA-B +CA + B-CHexokinaseHydrolasesHydrolysis reactionsA-B + H2OA-H + B

8、-OHTrypsinLyasesCleavage of C-C, C-O, C-N etc., often forming a double bondPyruvate decarboxylaseIsomerasesTransfer of groups within a moleculeMaleate isomaseLigases (or synthases)Bond formation coupled to ATP hydrolysisPyruvate carboxylaseA + B A-BX-A-B-Y Y-A-B-XX-A-B-Y A=B + Y-X酶的命名有两种方法：系统名系统名、惯用

9、名惯用名。系统名系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶惯用名惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。4.3 酶反应动力学酶反应动力学一、酶促反应动力学（单底物模型）一、酶促反应动力学（单底物模型）（一）米氏方程（一）米氏方程（Michaelis-Menten equation）v = Vmax Skm + S（二）（二） 米氏常数的意义及测定米氏常数的意义及测定 v = Vmax/2，则： km

10、= S意义意义：1. km是酶的一个基本的特征常数是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。2. 从从km可判断酶的专一性和天然底物可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。3. 当当k1k2 时，时， km的大小可以表示酶与底物的亲的大小可以表示酶与底物的亲和性和性。4. 从从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度的底物浓度。Sv1000km0.999V100km0.99V10km0.91V3km0.75V1km0.50V0.33km0.25

11、V0.10km0.091V从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则90%V =100%VS/(km +S)v = Vmax Skm + S即 S = 9km在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。5. km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶（1.010-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。最小的酶。（三）（三）Km的求解的求解 米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测

12、定不同底物浓度的反应初速度，从v与S的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的S即为km（近似值）。通常用Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）作图法（双倒数作图法）1v= kmVm S1+ Vm1（y = ax + b） 斜率= km/Vmax1/ S1/v1/Vmax-1/km（四）酶的活力（四）酶的活力1. 酶活力酶活力是指酶催化某一化学反应的能力（activity）3. 在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1mol/min4. 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1k

13、at=1mol/s 1kat = 6107IU2. 酶（活力）单位酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）5. 酶的纯度酶的纯度： 比活力比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）纯化倍数纯化倍数 = 每次比活力第一次比活力产率产率%（回收率）（回收率）= 100每次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法（五）转换数（五）转换数（Turnover number） Kcat的定义为：当酶被底物饱和时，每分子的酶在单位时间内催化底物分子转变成产物的数量。 KcatVmax/Et 代表酶的动力学效应（六）

14、（六） Kcat/Km Kcat:反映的是一种酶被底物饱和时的酶性质反映的是一种酶被底物饱和时的酶性质。在低在低S下下， Kcat则失去了意义。则失去了意义。 当skm， Kcat/Km是一个比较酶催化效率较好的一个动力学参数，是一个二级速率常数，有一个上限（扩散控制限制）：108109 molL-1S-1。（七）（七）pH对酶活性的影响对酶活性的影响pHv最适最适pH（ pH optimum ）1.最适pH ：表现出酶最大活力的pH值2.pH稳定性：在一定的pH范围内酶是稳定的pH对酶作用的影响机制对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解

15、离。Effect of pHPepsin胃蛋白酶胃蛋白酶Papain木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶Trypsin胰蛋白酶胰蛋白酶Cholinesterase胆碱酯酶胆碱酯酶过氧化氢酶（八）温度对酶作用的影响（八）温度对酶作用的影响两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快温度升高，反应速度加快； 2.温度升高，热变性速度加快温度升高，热变性速度加快。Tv最适温度BATypically二、多底物酶促动力学（只作了解）二、多底物酶促动力学（只作了解）双底物反应：A+B P+Q两种可能的反应机制：（一）顺次反应（Sequential reaction）1.有序顺次反应（Ordered reaction）2. 随

16、机顺次反应（Random reaction）（二）乒乓反应（Ping Pong reaction）4.4 酶的抑制作用酶的抑制作用能同酶结合，阻止ES复合物的形成或阻止ES复合物转变成EP反应的化合物（Inhibitor）。一、可逆抑制作用一、可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合都是非共价的，是可逆的；可以通过透析或凝胶过滤层析将可逆抑制剂去掉。有三种类型的可逆抑制剂1. 竞争性抑制剂（竞争性抑制剂（Competitive inhibitor）：只同自由酶自由酶结合，是底物类似物。竞争性抑制剂对竞争性抑制剂对酶动力学影响：酶动力学影响： Km 增大增大Vmax不变不变2. 反竞争性抑制剂（反竞争性抑

17、制剂（Uncompetitive inhibitor）：只能同ES结合，出现在多底物反应中，结构上同底物不类似。反竞争性抑制剂对酶动力学影响：反竞争性抑制剂对酶动力学影响： Km 和和Vmax 降低，降低， Km /Vmax比值不变。比值不变。3. 非竞争性抑制剂（非竞争性抑制剂（Noncompetitive inhibitor）：既能同自由酶结合又能同ES结合，结构上同底物不相似。有两种类型：（1）纯粹非竞争性抑制剂）纯粹非竞争性抑制剂：抑制剂同E和ES具有相同的亲和力（Ki = Ki/），Vmax降低降低，但Km不变不变。（2）混合非竞争性抑制作用：）混合非竞争性抑制作用：抑制剂同抑制剂同

18、E和和ES亲和力不相等时，亲和力不相等时， Vmax降低降低，但Km的变化决定于Ki 和Ki/之间的大小：Ki Ki/时，时，Km减小减小二、可逆抑制剂在酶学研究及临床上的应用二、可逆抑制剂在酶学研究及临床上的应用1. 酶活性部位研究： 乙酰胆碱酯酶的活性部位有两个：底物结合部位（阴离子结合部位）和催化部位（酯部位）。2. 新药物的研制：两个要求 （1）生物相容性； （2）选择性毒性：HIV的逆转录酶的专一性抑制剂AZT(3/-叠氮-2/, 3/-脱氧胸嘧啶核苷)三、不可逆抑制剂与酶共价结合三、不可逆抑制剂与酶共价结合不可逆抑制剂：与酶的某些基团共价结合共价结合，不能与酶自行分解，使酶失活使酶

19、失活。动力学：与非竞争可逆抑制作用类似，因为都是使酶活性丧失，但有区别： 1.酶活性随时间减少酶活性随时间减少；而非竞争可逆抑制作用，可达到稳态水平稳态水平 2.不能通过透析或稀释使不能通过透析或稀释使EI解离，酶活性恢复解离，酶活性恢复。应用：对于酶活性部位的组成，如必须基团的确定，不可逆抑制剂是一种很好的研究手段。4.5 酶的作用机制酶的作用机制Two questions：1. How can enzymes be so specific ？ 2. Where is the lowered part of the free energy of activation (G) ？两个基本原理：

20、两个基本原理：1. 酶的催化效率最终来自酶与底物之间弱酶的催化效率最终来自酶与底物之间弱的相互作用所释放的自由能；的相互作用所释放的自由能；2. 酶的活性部位与酶的活性部位与反应转换态反应转换态互补。互补。一、酶的底物专一性一、酶的底物专一性酶作用的专一性几何专一性（结构专一性）立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。RCOO- +R OH + H+酯酶酯酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶脲酶：H2NCNH2 + H

21、2OO2NH3 + CO2二、酶的作用机理二、酶的作用机理（一）酶的催化作用与分子活化能（一）酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式G =H -TS（ G是总自由能的变化， H 是总热能的变化，S是熵的变化）当G0，反应不能自发进行。当G0，反应能自发进行。活化能活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。促使化学反应进行的途径：1. 用加热或光照给反应体系提供能量。2. 使用催化剂降低反应活化能。 酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度需的活化

22、能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。加快。（二）中间产物学说（二）中间产物学说E + SESE +P中间产物存在的证据：1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。（三）分子识别（三）分子识别“锁锁-钥钥”模型模型： Loch and key hypothesis by Emil Fischer，1894“诱导契合诱导契合”模型模型（Koshland，1958）： Induced Fit HypothesisThe induced fit model (ex. of hexokinase)Before glucose bindingAft

23、er glucose bindingQuestion: Please compare the difference in mechanism of specificity among the serine proteases trypsin, chymotrypsin and elastase. （四）酶使转换态稳定（四）酶使转换态稳定 Induced Fit favors formation of the transition-state intermediate. 所涉及到的弱相互作用力：静电作用、氢鍵、疏水静电作用、氢鍵、疏水作用和范德华力。作用和范德华力。在非极性环境非极性环境中，静电

24、相互作用静电相互作用比在水中强强。（五）使酶具有高催化效率的因素（五）使酶具有高催化效率的因素1. 邻近效应（邻近效应（Proximity effect）： Proximity Orientation2. Acid-Base Catalysis：通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化，Bronsted的酸碱定义） 蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基、咪唑基、巯基和酚基。 影响酸碱催化反应速度的两种因素：（1）酸或碱的强度（pK）；（2）质子传递的速度。His的咪唑基咪唑基最活跃。 广义酸碱催化：使

25、反应速率提高10100倍。3. Covalent Catalysis：底物分子与酶分子上的活性基团间瞬间共价结合瞬间共价结合而形成中间物，快速完成反应。共价催化又称亲核或亲电子催化。实际上也是酸碱催化。Ser-OHCH2S ：HCH2O ：HCys-SHCH2C=CHHNNCH：His-咪唑基亲核物质亲核物质亲电物质亲电物质4. Metal Ion Catalysis几乎1/3的酶催化活性需要金属离子。金属离子主要以三种方式三种方式参与催化过程：1. 与底物结合，定向底物，定向底物，便于反应；2. 通过金属离子氧化态的变化介导氧化还原反应氧化还原反应，如Fe2+与Fe3+等；3. 静电稳定或者

26、掩盖电荷稳定或者掩盖电荷。（六）酶作用机制举例（六）酶作用机制举例1. 溶菌酶：活性部位在酶分子一个狭长的缝隙中，与底物有六个结合位点六个结合位点：A、B、C、D、E和F。催化反应涉及到：酶与底物结合酶与底物结合、Glu35广义酸催化广义酸催化、张力的产生及张力的产生及D糖环的变糖环的变形形、Asp52对正碳离子的静电稳定对正碳离子的静电稳定（转换态的稳定）。2. 丝氨酸蛋白酶：催化三联体（His57、Asp102和Ser195）。趋异进化趋异进化（Divergent evolution）和趋同进化趋同进化（Convergent evolution）3. 天冬氨酸蛋白酶：中间物分离的尝试至今未

27、成功。酶活性对pH要求：通常酸性酸性pH。4.6 酶的活性调节酶的活性调节（一）酶原的激活（一）酶原的激活 没有活性的酶的前体称为酶原酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。 在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。（二）同工酶（二）同工酶(Isoenzyme)能催化相同的化学反应相同的化学反应，但在蛋白质分子的蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。（来源不同）乳酸脱氢酶（LDH）MHMM MMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3H

28、HHHH4（三）别构酶（三）别构酶（Allosteric enzyme）有些酶具有活性中心和别构中心活性中心和别构中心，当调节物与别构中心结合时，酶的构象发生改变，导致酶的催化活性发生改变。这类酶称为别构酶别构酶。特点特点：1.一般是寡聚酶，四级结构； 2.具有别构效应； 3. v对S不呈双曲线，呈S型。Sv别构效应（别构效应（Allosteric effect）：调节物与别构酶的调节部位结合，诱导酶构象发生改变诱导酶构象发生改变，使酶活性部位与底物结合受到影响，从而调节反应速率的代谢过程。这种效应叫做别构或变构效应。调节物：调节物：1. 负调节物（Negative effector）：结合到别构部位，关闭酶的活性；2. 正调节物（Positive effector）：结合到别构部位，激活酶活性。（四）共价修饰（四）共价修饰主要类型：Ser、Thr或或Tyr侧链（OH）的磷酸化和去磷酸化来调节酶活性注意：注意： 磷酸化调节酶活性磷酸化调节酶活性可以是激活激活，也可以是关闭酶活性关闭酶活性，如糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶磷酸化后，酶从T态转变成R态（无活性到有活性）；丙丙酮酸脱氢酶酮酸脱氢酶磷酸化后则失去活性。（五）多酶复合物和多功能酶（五）多酶复合物和多功能酶多酶复合物多酶复合物：在第一节已经介绍过。优越性：一个反应的产