ngs与其他检测序技术流程的对比图文

1、1会计学ngs与其他检测序技术流程的对比图文与其他检测序技术流程的对比图文23ACSCSCCLC FISH FISH ARMSARMS肿瘤肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代 免疫组化 一代测序 数字PCR 二代测序5检测方法介绍6原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原

2、位确定某些化学成分的分布和含量。免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（DNA），一个是果（Protein），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来的。0分1分2分3分8荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH)(FISH)检检测测以以HER2HER2为例为例FISHFISH检测乳腺癌细胞检测乳腺癌细胞HER2HER2扩增代表性图例扩增代表性图例高倍扩增无扩增扩增无扩增12结果解读扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引物的3 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物。ARMS（

3、ASA）的特点是：“只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增”优势灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底操作简单，仪器费用较低廉检测时间短不足仅能检测已知突变类型不能得到具体碱基突变类型15数字微滴PCR (ddddPCRPCR)通过将微量样品扩大倍数稀释和分液(partitioning)，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。Copyright 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.17新一代高通量测序(NGS

4、)的原理新一代高通量测序(NGS)能同时检测不同形式的基因突变 Marc Ladanyi. 2015 ASCO Annual Meeting18检测方法检测方法优势优势劣势劣势可检测的变异形式可检测的变异形式AMRS-PCR1、灵敏度3%-10%2、扩增和检测同时进行，封闭的体系，减少污染的可能性1、只能检测已知突变2、如果检测突变点或者类型较多，出现特异产物概率也增加3、当检测位点较多时，对DNA样本需求增加点突变、小片段插入/缺失无法测融合、大片段以及热点测序荧光原位杂交FISH1、灵敏度高、特异度高2、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量1、通量低、成本高2、对操作和

5、判读技术要求高，不同读片者判读差异较大拷贝数变化、大片段插入/缺失、融合/重排。扩增的金标准免疫组化IHC1、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究2、经济快捷1、抗体的选择2、检测者组织的固定3、观察者解释方面的差异仅检测蛋白表达水平Sanger测序1、测序长度2、准确性高，灵敏度20%-30%3、能处理的处理重复序列和多聚序列1、通量低、成本高2、对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高3、灵敏度低点突变、小片段插入/缺失二代测序1、大规模、高通量2、能检测各种变异形式3、灵敏度1%-3%1、成本较高2、引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统的偏向性，同时读长也

6、比较短3、对数据注释和报告解读要求高点突变扩增融合/重排插入/缺失19方法方法检测层面检测层面样本需求样本需求优势优势劣势劣势IHCProtein组织 直接展现表达结果，直观主观判断，对操作人员要求较高，阳性判定不确定ARMSDNA组织，血液速度快，精准度较高无法测融合，扩增及大片段测序，热点测序ddPCRDNA组织，血液单位点精准度非常高，可以进行动态监测多位点血检匹配度不高，热点测序FISHDNA组织扩增是金标准，并且可以测融合主观判断，对操作人员要求较高，对融合的判别要求非常高，结果容易出错世和DNA/RNA普适性一次检测所有突变类型，多基因，精准度高价格略高，周期略长2021NGSNG

7、S只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型FISHFISH做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高，做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高，NGSNGS通过优化算法，通过优化算法，降低人工出错的比率。降低人工出错的比率。阴性对照极为重要，具有质控和探查种系突变的作用阴性对照极为重要，具有质控和探查种系突变的作用ARMS,ddPCRARMS,ddPCR等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高，等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高，但是本质上仍旧是热点测序，不能满足越来越大的检测需求但是本质上仍旧是热点测序，不能满足越来越大的检测需

8、求世和专有探针库保证了前期提取的世和专有探针库保证了前期提取的DNADNA质量质量检测全面检测全面精准度高精准度高周期短周期短样本需求少样本需求少全自动化的大数全自动化的大数据分析方法据分析方法时时更新的医学数据库高通量高通量单次检测中同时单次检测中同时发现多个基因的多种突变多个基因的多种突变 包括单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合单次反应只能针对一种突变进行检测，并只能检测一种突变类型同时对416416个致癌基因个致癌基因 进行测序展现所有突变每次反应只检测单个基因一种突变世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600600次以上次以上，杜绝假阳杜绝假阳/ /阴性结果阴性结果技术局限，假阳

9、/阴性错误率高只需一次微量一次微量 肿瘤样本，并且可以检测手术样本，血液/积液样本，FFPE石蜡样本等多次检测导致样本量大、价格高、耗时长实现数据分析的算法优化和分析自动化数据分析的算法优化和分析自动化，快速处理海量病人数据，杜绝人为错误杜绝人为错误技术局限无法及时有效处理海量病人数据以FDA逾三万份临床数据为基础，报告切实有用，有效帮助医生和病人选择高敏感性的药物有效帮助医生和病人选择高敏感性的药物不同实验室的各种报告而造成的信息重复或混乱，无法保证临床数据库的完善性和时效性检测流程高度自动化，7 7天天 提供全面准确报告多次反复测试，造成耗时长，而且由于技术局限无法提供全面的报告上一代传统

10、基因检测上一代传统基因检测高通量测序高通量测序 高敏感度高敏感度检测检测低丰度突变低丰度突变组织、胸水、组织、胸水、ctDNA 一次检测，多个基因，突变、扩增、融合平行检测 液体活检可在治疗期间动态监测疗效及耐药机制 数字化标准化的NGS平台，不同人员批次间高重复性如 何 避 免如 何 避 免因 异 质 性因 异 质 性引 起 的 片引 起 的 片面性面性微 量 样 本微 量 样 本如 何 满 足如 何 满 足多 项 检 测多 项 检 测需求需求如 何 实 现如 何 实 现患 者 的 全患 者 的 全程管理程管理如 何 解 决如 何 解 决人 工 判 断人 工 判 断造 成 的 主造 成 的

11、主观差异观差异25n动态监测药物疗效n动态监测耐药情况n有效评估预后Nat Rev Clin Oncol. 2013 Aug;10(8):472-84. 没有组织怎么办？ 初始诊断性活检是通过组织病理学、免疫组化和分子学特征描绘进行评估的，根据结果制订治疗方案 在获得性耐药时进行再活检，并采用同样的方法重新分析以发现耐药时收集的标本与治疗前标本的差异 该过程在各治疗阶段时重复进行 应形成可能的细胞株和患者衍生的移植瘤模型以促进耐药机制和治疗作用的功能性研究Politi K, et al. Clin Cancer Res. 2015 May 15;21(10):2213-20. 分子学特征和再活

12、检与癌症治疗的整合26肿瘤具有复杂的时空异质性不同位置具有不同病灶肿瘤亚克隆Andriy Marusyk, et al. Nature Review Cancer. 2012.Almendro V, et al. Annual review of pathology 2013.Zheng et al. Sci Rep6:20913 (2016).Thierry et al. Nat Med. 2014; 20 (4):319-449.现有的基于血清蛋白生物标记物（例如现有的基于血清蛋白生物标记物（例如CA-125CA-125和和PSAPSA）的无创检测方法）的无创检测方法存在一定数量的存在一定

13、数量的假阳性与假阴性假阳性与假阴性结果，并不能对肿瘤的进展做出准确判断结果，并不能对肿瘤的进展做出准确判断ctDNActDNA可从血液中较易分离可从血液中较易分离 （liquidliquid biopsybiopsy），并携带肿瘤特异性的体细），并携带肿瘤特异性的体细胞突变，因此极为适合作为胞突变，因此极为适合作为肿瘤无创诊断及监测肿瘤无创诊断及监测的生物标记物的生物标记物对对ctDNActDNA进行基因检测还可以及时发现进行基因检测还可以及时发现肿瘤复发后产生的抗药性突变肿瘤复发后产生的抗药性突变，而，而及时对治疗方案进行调整及时对治疗方案进行调整尽管肿瘤本身是肿瘤尽管肿瘤本身是肿瘤DNAD

14、NA的最直接来源，但是通过的最直接来源，但是通过活检或手术获取肿瘤组活检或手术获取肿瘤组织是侵入性的，具有一定风险的。而且有些癌症病人织是侵入性的，具有一定风险的。而且有些癌症病人不宜进行手术，无法不宜进行手术，无法获得肿瘤组织获得肿瘤组织进行基因检测，以帮助制定治疗方案进行基因检测，以帮助制定治疗方案2930世和基因的技术优势：世和基因的技术优势：大幅提高大幅提高ctDNActDNA回收率回收率从微量从微量ctDNActDNA建立测序文库建立测序文库ctDNA在血液中含量极少在血液中含量极少 ，片段较小，提取方法及其重要，片段较小，提取方法及其重要1建库及富集的产量建库及富集的产量2事实上，

15、ctDNA检测的核心在于前期准备以确保ctDNA文库的多样性，保证被检测样本有代表性是下游测序及分析的基石3132样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成33样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成优势在于每步优化！优势在于每步优化！QC步骤步骤34样本收样本收集集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成收到血样后2小时内小时内分离血浆血浆多种运输条件实验室模拟不能输在起跑线上！不能输在起跑线上！运输全血至总部再分离血浆季节地域温差大，影响质量直接影响检出率直接影响检出率世和基因世和基因其他公司其他公司Sci Transl Med. Aug 26,

16、 2015; 7(302): 302ra1332小时内收集血浆是小时内收集血浆是临床试验、高分论文金标准！临床试验、高分论文金标准！分离全血收集血浆，时间精至分离全血收集血浆，时间精至分钟分钟！35样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成DNA提提取取小片段含肿瘤特异突变大片段不含肿瘤特异突变血浆DNA经过大小片段分离大小片段分离有效富集小片段ctDNA！更丰富的起始原料更丰富的起始原料世和基因数据36样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成DNA提提取取0.5测序质量好测序质量好测序质量差测序质量差世和基因数据，基于100例临床病人石蜡样本测序结果37样本

17、收集DNA提取靶向富集上样测序数据分析报告生成样本建库样本建库上百种进口试剂反复搭配优化上百种进口试剂反复搭配优化极大提升建库效率极大提升建库效率38靶向富集靶向富集样本收集DNA提取样本建库上样测序数据分析报告生成 基因靶向富集15000余个探针 探针库反复优化14次，历时3年，保证每个基因每个外显子覆盖 探针单个合成，Mass Spec保证质量 7项核心专利探针单独合成质谱分析纯化世和探针库剪切探针库芯片大规模合成芯片合成探针的缺点：大规模一次合成多个探针统一剪切探针的完整性等品质无任何保证大部分探针都不完整，导致基因捕获效率大大降低芯片合成探针的缺点反复15000次39靶向富集靶向富集样

18、本收集DNA提取样本建库上样测序数据分析报告生成什么是探针的均一性（什么是探针的均一性（Uniformity）？探针覆盖不均一探针覆盖均一探针覆盖均一ALK19内含子测序数据的重要参数，除了测序深度，还有探针均一程度探针均一程度换句话说，如果EGFR覆盖3000X，而ALK只覆盖300X，将会严重影响检测敏感性检测灵敏度是由覆盖最低的基因决定的检测灵敏度是由覆盖最低的基因决定的如不均一，等于没测！如不均一，等于没测！40样本收集DNA提取样本建库靶向富集数据分析报告生成上样测序上样测序世和基因IlluminaHiseq4000/Miseq其他测序公司IlluminaIlluminaNextse

19、q500Nextseq500四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多数使用Hiseq平台二色荧光判别ATCG LED照相机 准确率和灵敏度较差 主要用于产前检测41样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成生信分析各类型突变反复研讨数据库比对最终突变列表ABC报告止于报告止于”一键生成一键生成”？报告初稿审核报告终稿终审/打印/发送协助医生进行临床突变研判 基本信息 突变解读 突变初筛A突变初筛B突变初筛C近近40人临床突变分析团队人临床突变分析团队42样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测

20、序数据分析报告生成临床测序数据涉及到病人用药方案需要人工排除假突变排除假突变需要人工验证真突变验证真突变除常见突变外需要查找文献查找文献MD Anderson、Foundation Medicine等国际领先等国际领先的中心机构，突变全部需要人工核查！的中心机构，突变全部需要人工核查！“假突变”：RB1基因16内含子重复区域低丰度突变： 1%的EGFR T790MPTEN基因5外显子C124S突变，是PTEN磷酸酶催化结构域内的活性位点，在脱磷酸化过程中，C124位点在攻击底物的磷酸基团，并形成一个硫代磷酸酯中间体。有研究表明，PTEN C124SA突变可导致PTEN蛋白的脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的双失活，进而可能激活PI3K/AKT信号通路罕见失活突变： PTEN C124S43样本收集DNA提取样本建库靶向富集上样测序数据分析报告生成NCCN/FDA/CFDA涵盖基因突变能够直接指导用药或提供预后信息在其他癌种已获NCCN/FDA/CFDA批准及本癌种II/III期临床试验中相关突变临床前研究数据中涵盖基因突变不能直接用来指导用药和预后Class I目前突变意义不明Class IIClass IIIClass IV44谢谢！ 45数字微滴PC