[精品]乳铁蛋白的分离工艺研究

1、乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为 富集的生物资源z。包括重耍的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（igg）、乳铁蛋白 （lf）及胰岛素生长因了 （igf）等，含量比常乳高10100倍。这些生理活性成分具有免 疫调节、延缓衰老、促进牛长发育、抑制肿瘤等牛物功能，不仅可以制造功能保健食品，而 且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。lf的一级结构是一条 多肽链，分子量为7080kd, lf上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳 糖、甘露糖、n乙酰半乳糖胺、藻糖等。

2、lf具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗 病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌醜再生、防止脂质过氧 化等。在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml,比常乳高近50倍。我国约有乳牛近430 万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋 口，因此生产乳恢蛋口的原料极为丰富，它的开发利用将带來可观的经济效益和社会效益。 但牛初乳具冇异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊z外，利用率非常低。初 乳木身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理 的分离技术路线以提収高纯度、高活性的天然活性

3、蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重 耍的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋 白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成木分离高纯度乳铁蛋白的目的。1原料与器材1.1原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3d内收集的样品，cm-sephadex 050：进口分装bmk （shanghai） sci& tech ltd, cm-sepharose fast flow, lf标准样品、电泳级丙稀酰胺acr、电泳级 甲叉双丙稀酰胺bis、分析纯tris碱（三瓮甲基氨基甲烷），化学纯sds（ i二烷基磺酸钠）， 分析纯temed （四甲基乙二胺），过硫酸胺ap,

4、分析纯廿氨酸，考马斯亮蓝r250等。 1.2实验仪器sbs100数控计滴自动部分收集器、hd2188核酸蛋白检测仪、3057 portable recorder. bt01-100兰格恒流泵、th-500梯度混合器、phs-25型ph计、dyy-8b型稳 压稳流电泳仪、dyiii 28a型电泳槽、751g分光光度计、tdl-5000b冷冻离心机。2实验方法2.1分离方法2.1.1凝胶的预处理取液体胶与去离子水1混合，浸泡，沉降装柱。以2bv的流速先川碱洗2.5h （5倍 胶体积），用去离了水洗至ph值为7.0左右，用酸洗2.5h,用水洗至ph值为7.0左右，再 用碱洗2.5h,后用水洗至ph值

5、7.0左右备用。2.1.2牛初乳的脱脂取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心30min （4 800r/min, 15°c）,去上层油脂。2.1.3阶跃洗脱的方法5%nac) w峰1.6沁c洗脫峰i!图 1 cm-sepharose fast flow 洗在4°c条件下动态上柱吸附8ho去离子水以1bv的流速洗柱约10h,待基线走平，用 1.6%naq洗脱约需5h,期间杂蛋口被洗脱卜-来，待基线再度走平，使用5.0%nao洗脱， 洗脱产物为lf （粉红色），出峰吋间为1h左右。洗脱曲线见图1。2.1.4 cm-sepharose fast flow 的穿透曲线（图 2）穿融线一-&

6、#163;1 , 04小日寸10另钟5小日寸“5分钟t'图2穿透曲线在实验中利用纯度为97%标准样品配制浓度为4.80g/l的lf溶液，在约5bv流速下测 定胶体积为62ml的cm-sepharose fast flow的穿透|11|线。根据洗脱记录可计算得到在 穿透点到达询，cm-sepharose rst flow的实际吸附容量为2g左右。2.1.5透析取洗脱液于透析袋，放在蒸憎水屮24h,中间每8h换一次水，除丈洗脱液屮的盐类小分 子。2.1.6干燥冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。2.2分析方法2.2.1蛋白质测定用核酸蛋口检测仪测定蛋口质。2.2.2乳铁蛋白纯度的分

7、析用hplc法和凝胶电泳法进行纯度分析。3结果与分析3.1交换剂的选择根据乳铁蛋白的特性，木实验选用弱酸性阳离了交换剂，并选川na型交换剂作为贮存、 吸附时的离子型。比较了 cm-sephadex 050和cm-sepharose fast flow 2种树脂的分离效果。表 i cm-5ephadex c-50 与 cm-5epharo5e ff 洗脱紐 比鮫翦子交换剂初乳体积(1)洗脱液体积ml)洗脱液中lf液度) lf/tl牛初乳(创)lf的纯度()cm-sephadex c-502451.840.415舛9cm-sepharose ff2621.610.50096.9从表1可以看出，相同

8、单位量的牛初乳原料进行实验，cm-sephadex 050和 cm-sepharose fast flow相比，洗脱得到的lf的虽:和纯度都相差不大，只是 cm-sephadex g50得到的洗脱液呈较深粉红色，而川cm-sepharose f7st flow洗脱 得到的洗脱液颜色略浅一些。使用相同的装柱方法时，cm-sepharose fast flow比cm-sephadex c-50更容易操 作，且在实验过程中体积不会发生变化，冇利于实现工业化生产。同时由于装柱过程对洗脱 效果也有相当程度的影响，故后继实验选用cm-sepharose fast flow为交换剂。6.93.2吸附方法的选

9、择(见图3)6.8肛 丘6-76.6f6.5 6.412345时间(b)静态吸附图3 两种吸附方法的ph值变化离子交换色谱的吸附方法主要分为静态吸附与动态吸附2类。静态吸附需要的时间比较 少，但是无法实现连续操作，只能停留在实验室小规模提取阶段，缺乏工业化生产的可能性。 而动态吸附比较容易实现产业化，需要的时间一般随原料的虽而变化。2种吸附方法在后期的ph值基本保持稳定，说明牛初乳具有良好的缓冲功能。由于静态吸 附后的吸附剂难于装柱，故选用动态吸附法。3.3吸附速度的选择由于在工业化生产屮为了提高生产效率，必然在不影响产品得率的前提下降低生产周期。 而牛初乳的上柱吸附时间在整个生产环节中占了很

10、大的一个比例。尽可能的提高牛初乳的吸 附速度成为工业化生产的必然选择。由于吸附速度受牛初乳的理化性质及离子交换柱的径高 比等因素的影响，本实验只在现有条件卜比较了 3种不同吸附速度的效果比较。从表2我们可以看出3bv和5bv两个吸附速度的产品得率相差不大，7bv的收率偏低，估 计已超过穿透速率。故选用5bv的吸附速度。表2 3种吸附速慶的lf得举比较吸附速度 初乳体积(i)洗脱液体积(ml)洗脱液的lf浓度(知lf/il牛初?l(g/l) lf的纯度您)3bv2671490j5ot96.95bv2621.56048695.87bv242150031595.63.4洗脱方法的选择洗脱方法中，授常

11、用的是阶跃洗脱与梯度洗脱法。2组梯度洗脱实验，分别使用5%nao 以及10%nao的浓缩液，稀释液均为去离子水。表3 阶跃洗脱与梯皮洗脱效果比较选脱方祛初乳体积（i） lf洗脱液体积（ml）洸脱液中lf浓度（却lf/il牛初亂（”l） lf纯度（莎脱2621.6100596.9梯颇脱(5%nacl)52000.400.1681.7梯度洗猊（10%同）51800.5083.65%nac梯虜那图4 5%nacl梯度洗脱曲线10沁c梯度剋兌團5 10%nad梯度洗脱曲线表3中可以看出，阶跃洗脱的效果要好于梯度洗脱。从洗脱曲线上（见图4、图5）可 以看出，梯度洗脱的梯度没冇掌握好，峰都重叠在了一起，没冇达到要求的分离度。可能是 梯度太小，从而流动相的浓度增大，速度太小，峰型过宽，影响了最终的分离度。从洗脱曲 线上也可看出，随着梯度洗脱的梯度的增大，峰型变得窄一些和陡一些，洗脱效果也有所提一 咼。3.5产品的透析和冻干（见图6、图7）洗脱液经透析24h后冷冻干燥，得lf固态产品。样品图6乳铁蛋白产品的sds-pace电泳图谱图7产品的高敷液相色谱图4结论本文主要对牛初乳中乳铁蛋白lf分离纯化的工艺进行了研究，并对其工艺流程实现了优 化。得到最佳洗脱工艺：使用cmsapharoserst flow装柱，再转化为na型，然后 用脱脂牛初乳作为