qPCR试验操作流程

1、使用RNase-free的DNase? （Promega）,按以下体系配置反应液，37°C消化30min, 65°CQ-PCR实验流程一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/ 一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取 EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

2、二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入ImITrizol （Inv itrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解，室温静置 5min ；组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol （ Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2） 加入200卩氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min:（离丿I $ f I I心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4C下，14,000g

3、离心15min,可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰至V、吸到中间层）4）沉淀RNA :加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min:5） 4°C下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见 EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在 4C下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6） 用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP管即

4、可，不 用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因组灭活10mi n。RNA30m1DNase?20m110xbuffer10m1H2O(RNasefree)39.5m1RNasi n0.5m1总体积100m1然后按以下步骤操作:1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min，后14,000rpm,离心15min，取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8次）

5、，-20 C静置15min;4）4C下，14,000g离心15min,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。、 '. ,' |四、总RNA纯度和完整性检测1）纯度检测：取1卩IRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD值，OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取 RNA样品1门1%琼脂糖凝胶电泳80VX20min, EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA, 18srRNA和28s

6、rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。V ；./-.'J五、逆转录l. mRNA :1）在RNasefree的PCR管中配置下列溶液2）将上述溶液吹打均匀，置变性。随后立即冰上致3）在该PCR管中加入下列TotalRNA 1.0H2OM3卩1总体积85C 保温 5min，使 RNA冷，以防止RNA复性；试剂（Promega来源网络10mMdNTP(promega)2.0plRNase in hibitor(promega)0.5plU6逆转录引物/1、J J0.5pl5xbuffer4.0plM-MLV(promega)0.5pl1总体积7.5pl4）将3）溶液加

7、入到1）溶液中，混匀后30C保温10min；2）将上述溶液混匀,3）在另一去溶液:oligo (dT)0.5Ran domprimer0.510mMdNTP2.0RNase in hibitor0.55xbuffer4.0M-MLV0.5总体积8.014）将上述20卩反应溶液30E保温10min;5）42E 保温 50min;6) 85E 保温 10min;7) -20 C 保存。2. microRNA :使用茎环逆转录法，原理如下图:totalRNAX个miR逆转录引物出01.00.5*XPg总体积12.5pl1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液.随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次

8、恢复二级结构;的PCR管中配置以下RNase开RNA二级结构。85C孵育5min，以打5) 42C孵育 50min；6）85E孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1引物测试:根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。来源网络得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2 确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序

9、。（1） 一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但 同一次重复的实验不能分开两板3 正式实验：体系配制：H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul（TOYOBO）（使用前需振荡均匀）上游引物0.5ul （10uM）下游引物0.5ul （10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份-1份体系。'I I ' ' ' I总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3. cDNA用灭菌纯水

10、稀释适当的浓度，一般为 1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低 稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖 好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好 1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上， 八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）4 把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五. 上机：5.1先开电脑，进入 Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件，选择“新建”，在“ Template”下拉菜单中选择“ 60”或“65” （普通基因检测为“ 60”，MicroRNA 检测为“ 65”）5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的 孔位。5.4点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5点击Start键，开始运行程序。来源网络5