G418筛选实验

1、G418筛选实验相关问题点击次数： Jd 1011 作者：guodengjun12 zhaolifei sandy99 等发表于：2008-08-06 23:39 转载请注明来自丁香园来源：丁香园问：G418筛选预实验用未转染的细胞做，选 10-14天内细胞死 亡的最小浓度，然后将更高一级别的浓度应用于转染的细胞， 是这样 吗？答：G418是一种细胞毒性药物（氨基糖苷类抗生素），依不同浓度，对细胞有一定的抑制或杀伤作用，而拟转染的质粒上带有G418的药代酶，能降解G418，从而使细胞获得对G418的耐药性。也 就是说转染后的细胞可以耐受 G418，而未转染成功的细胞不能耐受 G418，因而被杀

2、灭或抑制。通过 G418筛选体系，使得未转染成功 的细胞比例不断减少，转染成功的细胞比例不断增高。如果G418浓度太高则会杀伤所有的细胞，如果 G418浓度太低则没有什么毒性， 两种情况都不能起到筛选作用。G418筛选预实验则是先用未转染的 细胞做，选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞，因为不 同的细胞对G418的耐受性也不一样，这样的目的是找一个实验细胞 能耐受G418的工作浓度，从而为筛选转染的细胞打下基础，因为这种浓度只能抑制未转染的细胞， 而不抑制转染成功的细胞的！从而起到筛选作用。 建议你再多查找一下国内外相关文献， 实验动手之前一 定要明白其原理， 要不然会很盲目， 充分的

3、准备可以避免走很多不必 要的弯路！问：第二次筛选要怎么做？答：第二次筛选就是将转染好的细胞接种培养后，向培养液中加 入 G418 以杀伤或抑制其中的未转染成功的细胞， 因为不管转染效率 多么高，都不可能是 100% ，所以要通过 G418 筛选体系（或者其他 筛选体系） 来筛掉那些没有成功转染的细胞， 此时加入 G418 的浓度 可以略高于你第一次预实验时摸索出来的 “最小有效浓度 ”，实验中可 以再根据细胞生长情况进行浓度的调整！问：第二次筛选是经过第一次筛选以后，已经筛选出一部分转染 细胞了，但是因为有些细胞还是会丢失目的基因所以要得到稳定表达 的细胞还要进行 2-3 次筛选， 这时候还是

4、用原来预实验的浓度， 还是 要再提高一个浓度？答：你要在荧光显微镜下观察一下，判断一下细胞转染的效率， 也就是转染成功的细胞的比例， 再根据情况选用或高或低的浓度！ 转 染成功的细胞的比例越高，则加入 G418 的浓度就可以越低。问：我的质粒上没有荧光标记，要等到筛选完了以后打动物的， 那要怎么办呢？答：可以用免疫细胞化学检测！问：做 G418 筛选预实验时每个浓度是不是要多弄几个孔，还是 一个孔就行了？筛选的培养液是不是要用没有双抗的， 做稳定转染时 必须用 DMEM 培养基吗？答： 用什么培养基视你培养的细胞特性而定吧 不见得非用 DME M，一般设三个复孔就足以 各浓度3复孔，设正常对照

5、3复孔。以 10-14 天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度。 由于基因转染到细胞内之 后要一段时间才能表达出蛋白质。 所以筛选不能太早， 但是也不能太 晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了 就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克 隆，一般要在转染 24 h 之后才开始加 G418 筛选 。答： 每种细胞的生长状态和速度不同，在一些细节处理上可能也 不同。我的是这样做的：1、G418 筛选实验：转染 293 细胞，生长较快，所以在 96 孔板中加 入100ul细胞（2000/ml），第二天就加入 G418 ,从0, 100 , 200 1000卩g/ml,

6、复3孔，每天观察。前几天，低浓度的孔中细胞生长， 中浓度的细胞生长缓慢,高尝浓度的不长,稀稀拉拉。约一周左右, 中浓度的孔中出现死细胞, 低浓度的死细胞较少, 未加 G418 的孔长 得很密。14天时，观察细胞全部死亡的最低浓度孔， 在500卩g/m, 做稳定转染时选用的600卩g/m。2、稳定转染：24孔板，细胞密度也较小，转染后第二天1 : 10稀释 传代，设立空白细胞对照组，第三天加 G418（600卩g/ml）。耐心等 待2周，前一周细胞死亡较少，后一周死细胞较多，可 3天换液，待 对照组里的细胞全部死亡，就可以开始挑单克隆了。http:/www.bio on .com/experim

7、e nt/sol/244209.shtmlG418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成G418是一种氨基糖苷类抗生素，这种氨基糖类抗生素的结构和新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601 , Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当neo基 因被整合进真核细胞 DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为 mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G 418的选择性培养基中生长。G 418的

8、这一 选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方 面得以广泛应用。G418使用方法 室温下运输，干粉在室温下储存，溶于水、甲醇，溶 液于-20 C储存 由于各真核细胞系对 G418敏感度不同,各新细胞系 或株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量需要通过实验优化。最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。将细胞稀释至1000cell/ml，每 孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml 等 12 个 级别 , 培养 10-14 天，以最低细胞全部死

9、亡浓度为基准， 一般 400-800 左右， 筛选时比该浓度再高一个级别， 维持时使用筛选浓度的一半即 可。G418 选择浓度范围细胞系或机体 G418 浓度( ug/ml )中国仓鼠卵巢细胞 700800Madin Darby 犬肾细胞 500人上皮 A431 细胞 400猿 CV-1 细胞 500盘基网柄菌属 1035植物 10酵母 125 500G418质量指标G418 :白色粉末，融点138144 C,溶于水、甲醇。 CAS No.： 108321-42-2分子式 : C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 : 692.71结构式 :比旋：+104O+1210 水分：<

10、10% 吸光值：< 0.015(280nm,1mg/ml),< 0.1 (570nm, 100mg/ml)效价： >700 ug/mg储运室温下运输，干粉在室温下储存，溶液于-20 C储存。Q： G418 怎么配制？A:我觉得不能用水配，因为这样 PH会变化很大，至少要用 PBS 我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中， 加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过 滤，20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml水中，0.8 g NaCI, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H

11、2O, 0.1 g 葡萄糖， 0.5 g HEPES, 溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。Good answer:推荐用HEPES特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时， 如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的 pH值，影响细胞 的生长。1mol/L HEPES的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml 的 ddH2O，用 10mol/L 的 NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0，定容至 50ml, 0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高 浓度的G418直接加

12、进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418 杀伤曲线， 300ugml 就基本上可以杀死细胞， 我想直接用 1000ugml 来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？A: G418 筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至 1000cell/ml ， 每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418 浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等1 2个级别，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般 400- 8 0 0左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度 的一半

13、。G418 浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克 隆都没筛到，欲速则不达。Q: 我用 24 孔板做了 G418 筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l 。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个 浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完 了之后存活的细胞再培养传代的话， 培养基中是否还应该加一定浓度 的G418?如果要加的话什么浓度比较合适？A: 应该保持这个浓度 9 天以上，每 3 天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418, 般在最

14、低致死浓度的 60% 左右。Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3 细胞转染后的 G418 筛选， 2 周后单克隆 形成 ， 于 是就挑 取 单 克 隆，之 前 6 孔板 里 的 细 胞 很多 ， 用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化， 1000 转/分离心 10 分钟 ，肉眼 可以 看到细胞沉淀，接种至 25ml 塑料培养瓶中，镜下看密度可以， 但是细胞形态成多态性：少量是圆形， 大多数是梭形。 第2 天一看没 有细胞贴壁！做了 2 次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？ A: 看了你的操作步骤， 个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆， 在 6 孔板里用 G418 筛选两周

15、后只是大部分细胞死亡， 少数细胞存活 并逐渐生长，只能叫作克隆形成。我们一般在转染后 24h 将细胞消化下来( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA),以1: 10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培 养基开始筛选。 待大部分细胞死亡， 极少数细胞渐形成克隆。再把这 些克隆经 24 孔板、 6 孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作 方法见附件)。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行 2-3 次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克 隆放大的过程中动作一定要轻柔， 否则很容易出现你所说的细胞不贴 壁死亡的现象， 也可以在消化完用正常培养基， 待细胞贴

16、壁后再换为 含 G418 的培养基。还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后 续试验。你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二 ;一、细胞很少，那么你接种 后，由于密度较低， 细胞是接触生长， 所以密度太低， 细胞难以生存。 二、拟消化下来可能用 G418 筛选液筛选，这样也会死亡。消化后先 用无 G418 的培养液培养，贴壁后，再换取 G428 培养液。Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来， 书上说用弯 头吸管， 我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺， 但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别 的好办法吗？谢谢了！A: 如何挑选克隆。你可以按以下操

17、作方法进行：【操作方法】（1）将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个 克隆位置用标记笔标记准确；（2）在超净台内，弃去培养皿内的培养液；（ 3）用镊子夹取一块滤纸块， 用 0.25%Trypsin 消化液浸湿， 置于所 标记克隆位置处， 5-20 秒；（有人可提前在一孔中装入 0.02%EDTA PBS）（4）将 24 孔培养板每孔加 G418 选择培养基 2ml ，用镊子取出已黏 附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次， 以使黏附的细胞脱落下。 镜下观察确认细胞已经脱落后， 将滤纸块取 出弃掉，其它克隆方法转移同上；（有人在细胞贴壁后再选用培养基）（5）将

18、移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37C 5%CO2培养箱培 养， 2-5 天；（ 6）待细胞长满后， 0.25%Trypsin 消化液消化，并将细胞转移至 6 孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。Q:用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中 扩大培养，但发现与正常 HEp-2 细胞相比，建系的细胞生长得很慢， 细胞间的边界也不是很清楚， 而且细胞长得不均匀， 这样正常吗？为 改变这一状态，我该怎么做呢？谢谢！A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常 细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大， 生长缓慢， 细胞界限不 明显及细胞爱成

19、堆生长等等； 有的则变化不明显。 对于稳定转染的细 胞，建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复， 因为你转入 的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前 进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；另一方面， 如果插入的质粒明显和细 胞周期有关的话， 这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。 在传代 过程中， 也可以使用正常培养基， 但过一段时间一定要用维持剂量的 含 G418 的培养基压一压，以除去回复的细胞。1. G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏 水至 1 0m l ，过滤消毒， 4 度保存。2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等

20、量接种入多孔 培养板中，培养 6 小时左右开始加药。3. 制备筛选培养基：在100ug/ml1000ug/ml范围内确定几个梯度， 比如先做个 100ug/ml 、 400ug/ml 、800ug/ml 、1000ug/ml ，按梯度 浓度用培养基稀释 G418 制成筛选培养基。4. 加 G418 筛选:5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35 天更换一次筛选培养基。方法同 4。6. 确定最佳筛选浓度：在筛选 1014 天内能够杀死所有细胞的最小G418 浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳 G418 浓度的 可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度 G418 的量在

21、筛选 14 天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418 的量在 10 天前就看不到活细胞了。假如是 400ug/ml 不能杀死细胞，而 800ug/ml 在第 5 天就把所有细胞都杀死了，则可以再用 500ug/ml 、 600ug/ml 、700ug/ml 进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由 于特性明确的细胞系 G418 的最佳用量还是比较稳定的， 所以有时候 不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染 NIH3T3 细胞 ， 现在我告诉你我测试过 NIH3T3 细胞对 G418 的敏感性，我用的筛选 浓度是 200 ug/ml 。这时你就可以做 150ug/ml 、200ug/

22、ml 、 300ug/ml 三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。a 转染：转染后培养 24 小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按 1 ：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50 %70%汇合时；b加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的 G418 筛选培养基。c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每 35 天更换一次筛 选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把 G418浓度减半维持筛选。 筛选 1014天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增 大后；d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到 1 个/10ul。在

23、96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孑L。 待其逐渐增大后转入到 48 孔中增殖。e单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总 RNA,做RT-PCR检测目的 基因是否存在。常见问题：1. 转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？ 无怪乎两种形式： 整合在染色体中和存在于细胞质中。 没有经过筛选 前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的， 但是这种质粒是不稳 定的， 基本上筛选不出这种单克隆， 只有稳定整合入染色体的才是我 们想要的稳定细胞系。2. neo 基因和目的基因是不是一定会整合在一起？整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都 表达，所以在筛选之

24、后还要用 RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧体内的任何细胞被置于体外培养后， 对环境都有一个适应过程， 期间 细胞对培养液具有同化作用， 即细胞从培养液中摄取营养的同时， 也 向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质， 其中有排泄物也有促 细胞生长因子。 这个过程也是细胞同化培养基的过程。 细胞越多则其 同化作用越强， 所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大 批细胞死亡， 不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响， 换液 后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强， 也不利于生长。 我是用 适应性培养基来解决这一问题的： 适应性培养基的配制 a培养同源细胞至半汇合状态时

25、，更换一次培养液，再继续培养2448 小时后，吸出所有培养液b 离心： 3000 4000rpm 10 min 后，吸取上清液c 虑过：再经直径 0.22um 滤器过滤，再加入 2 倍体积的新鲜培养基， 低温冻存备用。eeflying1. G418 筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至 1000cell/mL ， 每孔 100uL 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418 浓度稀释至 0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700 ， 800， 900， 1000， 1100ng/mL 等 12 个级别。培养 10-14 天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，

26、一 般 400-800 左右，筛选时比该浓度再高一个级别， 维持使用筛选浓度 的一半。2 .我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有 G418，很快会形成优势的。3 .即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重 要的。转染后， 每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的， 目 的蛋白表达有的多， 有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较 小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势， 长期之后， 表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要， 转绿色荧光蛋白 基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作， 使得到

27、的均来自于同一祖先细胞， 遗传性状尽量一致， 也是对高表达 细胞的保护。操作用 96 孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留 200cell 左右 就可以进行该操作了， 该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培 养书中均有讲述。1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且 不是单拷贝的，这点我们做过 FISH 验证过，表达量与整合数目，上 游序列特性，特定部位 DNA 立体结构都是相关的，装入了 SV40 只 是增加了表达了数目， 但并不能掩盖其它因素对表达的影响。 按你的 讲法，转染完 GFP 的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。 neo 基因也是这样， 而且，同一细胞中不

28、同基因的拷贝数不会相同， 不同 细胞同一基因的数目也不会相同， 这点可以用数学关于泊松分布的观 点理解。有时， neo 表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。2. 那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一 细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因， 那么，一种基因拷贝 数为 0 的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小， 很大的 概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓 100 个红球， 再抓 100 个黄球，然后以从中抓若干个， 这些球均为红球的概率有多 大呢？应该是很小的。红球就是 neo ，黄球就是你的目的基因。我们 用 neo ，实际上是筛选的外源基因整

29、合的数目，怎么说呢？用刚才的 例子来说，如果我们抓着 5 个红球，另一次抓着 10 个红球，可以肯 定，第二次抓的球比较多， 那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。 或者隔一定时间从新使用筛选量压一下， 我不知你是否干临床， 想想 抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。4. neo 的产物是酶，过高的 G418 浓度就要有更多的 neo 酶来支持， 否则细胞也要被毒死的， 而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大 负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖， 我们曾试过， 即使在同一

30、转染阳性细胞，在不同浓度的 G418 液中生长速度也不同，严重形态 也不同。 这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方 程理解吧。5. 胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响， 由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理， 实在是个人 经验， 而且在基础科学领域顶多算票友， 我还是想听听诸位专业人士 的理解和经验。在第 10 天左右就手挑单克隆或者 96 孔板单克隆操作了 本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一 级，维持用筛选浓度的一半。汇合度 (confluence) 也许是我们实验室的翻译，实际上就

31、是指细胞占 培养表面的比例， 如果细胞铺满了整个容器， 我们就认为它们 100% 汇合，也就是汇合度 100% 。最近的一个实验是：3X106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接 种 1/4000 和 1/1000 和 1/300 到 24 孔板中，48 小时后加 g418 筛选， 这个时候接种了 1/300 细胞的孔会大约 50% 汇合，而理论上接种了 1/4000 细胞的孔会 4% 左右汇合，今天是筛选后第 9 天，观察到 1/4000 孔有两三个小克隆，按道理 1/300 孔会有 20-30 个克隆，但 实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！ 所以我认为汇合度对 g418 筛

32、选影响很大，这耽误了我将一个多月。 jiangql 同意菊花与刀对你的建议。我的感觉 G418 筛选时间太长， 到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考： 首先需要扩增细胞， 冻存部分中间产物细胞后， 再做克隆化比较合适， 否则一旦污染就会全军覆没。一般57天后G418就可以减半维持。 勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。 血清浓度可以高到 20 ，质量要好。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因 (经测序验证) 准备真核表达载体将目的基因插入 表达载体中转染筛选鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、 试剂准备1、HBS( He pes

33、-buffered saline )：876mg NaCl 溶于 90ml ddH2O ， 加入 1M Hepes,调 pH 到 7.4,补 ddH20 至 100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。、操作步骤 （一）克隆目的基因1、根据 GenBank 检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5'-端分别引入酶切位点BamH I和Xho I,行RT-PCF。2、回收特异性扩增片段，连入 T 载体。3、转化DH5a,质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二）真核重组表达载体的构建：pcDNA3 载

34、体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、 便于挑选带重组质 粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源 DNA 序列所必需的所有真 核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamH I和Xho I双酶切回收插入片段和 pcDNA3 线性片段T4 连接酶连接转化DH5%质粒制备BamH I和Xho I双酶切鉴定。（三）重组 pcDNA3 转染 SHG-44 细胞：1、G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板-G418分别 用 100mg/L 、 200mg/L 、 300mg/L 、 400mg/L 、 500mg/L 、 600mg/L 加入， 各浓度 3 复孔，设正常对照 3 复孔。以 10

35、-14 天细胞全部死亡 的浓度为筛选浓度，结果为 200mg/L 。2、在转染实验前天接种细胞， 各种细胞的平板密度依据各种细胞的 生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到 60%-80% 覆盖。 一般要求，6孔培养皿（35mm ）,每孔1-2ml培养基3X105细胞。 依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。 典型贴壁细胞平板密度培养板大小 生长面积（ cm2） 大约细胞数 培养基容积（ ml）组织培养皿（© 60mm）2866X1055-66孔培养板（© 35mm）9.53X1051-212孔培养板 © 22.6mm)413X10505-124 孔培养

36、板1 © 8mm)05 06X105025-053、 SHG-44细胞的转染：（1）转染当天，加入脂质体 / DNA 混合物之前的短时间内，更换 1ml 新鲜的有血清或无血清培养基。 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最 佳比例。 溶液A：用HBS稀释DNA（ pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5卩g到总体积50卩1（30卩g/m）。溶液B:用HBS稀释6卩脂质 体到终容积501（ 120卩g/ml）。混合溶液A和B,轻柔混合（不要 振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。（3）不要移去培养基，逐滴加入100卩脂质体/DNA混合物（从

37、培养 孔一边到另一边） ，边加边轻摇培养板。37 C孵育6hr。（5） 6hr 后更换转染培养基，加入 2-3ml 新鲜生长培养基 屋尸转染24hr后施加筛选压力，改用含 G418的培养基培养。4、G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆， 扩大培养，同时转染 pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即 SHG-44。(一)筛选结果鉴定：(1) 基因组DNA提取-PCR鉴定外源基因(2) SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰 胺凝胶电泳免疫印迹鉴定 P16蛋白表达(Western-blot )。(3) 测定外源性基因对SH

38、G-44细胞增殖的影响 流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组 pcDNA3单细胞悬液70%酒精固定裂解细胞核糖核酸酶消化碘化 丙啶染色上机分析 G1期和G2/M、S期比例。 细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA35X104/孔接种24孔培养板24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞 计算细胞生长抑制百分率。 软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3 104细胞0.3%低熔点琼脂糖培养1-2周后计数不可少 于50个细胞的克隆数计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、优化转

39、染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体 和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸 应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。 但是， 脂质体以及脂质体/ DNA 混合物无需滤过除菌。2、预备脂质体 /DNA 混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂 质体 / DNA 与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部 分。3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37 C预温。4、脂质体 / DNA 混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿 一边到另一边， 边加入边轻摇培养皿， 以确保均匀

40、分布和避免局部高 浓度。常见问题和解答：Q:我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。A:也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞, 套环可能更好 .用96孔板法,如果不是每孔单个细胞 ,就不能保证是单 克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个 ,一个 96 孔板也只能培 养一万个细胞 ,十万个细胞就至少需要 10 个板,100 万个细胞就需要 100 个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶 ,工作量就太大了 .且细胞 在单独生长条件下 ,远远不如千万个细胞共同培养活力好 . 因此还得 看这位朋友使用的是什么细胞 ,有限细胞系还是无限细胞系 ,转基因还 是非转基因 ,筛选还是不筛选 ,

41、需要的单细胞克隆株数量多少 ?Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的， 含neo抗性基因的质粒后， 如何用G418筛选？我查看了国内、外 50几篇文献后发现没有一个 定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。 我自己认为， 从理论上讲， 如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代 后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、 维持剂量以及筛选 持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定 关系？A： 1. G418 筛选要做预 试验确定最佳浓 度， 将细胞稀 释至 1000cell/ml ，每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418 浓 度 稀

42、释 至 0,100, 200,300,400,500, 600,700, 800,900,1000,1100ng/ml等1 2个级别，培养10-14天，以最低细胞全部死亡 浓度为基准，一般400- 8 0 0左右，筛选时比该浓度再高一个级别， 维持使用筛选浓度的一半。2。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候 抗性基因会丢失，如果没有 G418，很快会形成优势的。3。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重 要的。Q:请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关 系吗？A:转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的， 目的蛋白表达有

43、的多， 有的少， 外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷 较小，所以生长较快，在生长若干代之后， 表达少的细胞会形成优势， 长期之后， 表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要， 转绿色荧光蛋白 基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作， 使得到的均来自于同一祖先细胞， 遗传性状尽量一致， 也是对高表达 细胞的保护。操作用 96 孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留2 0 0 cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体 和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。必须指出， 单克隆化要做几遍， 一遍是不够的， 我前十代都是这样的， 结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很

44、多。 现在很多代了，很 稳定。Q ：1。我的质粒中含有 SV40 与 neo 基因，好像就不存在外源蛋白 表达少的细胞形成优势这个问题了吧。2。按您的讲法， 筛选要进行 10 代，那么维持剂量要进行多长时间？ 如果我使用对照组 ,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养 行吗？3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养 基中存在 G418 对细胞是否有影响？4。既然细胞表达 neo, 从理论上讲是否无论多大浓度的 G418 对之都 无影响？A： 1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而 且不是单拷贝的，这点我们做过 FISH 验证过，表达量与整合数目， 上

45、游序列特性，特定部位 DNA 立体结构都是相关的，装入了 SV40 只是增加了表达了数目， 但并不能掩盖其它因素对表达的影响。 按你 的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo 基因也是这样， 而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同， 不同 细胞同一基因的数目也不会相同， 这点可以用数学关于泊松分布的观 点理解。有时， neo 表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。2。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因， 那么，一种基因拷贝 数为 0 的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小， 很大的 概率为外源基因

46、的不均质。打个比方，一个大口袋，抓10 0个红球， 再抓 100 个黄球，然后以从中抓若干个， 这些球均为红球的概率有多 大呢？应该是很小的。红球就是 neo ,黄球就是你的目的基因。我们 用neo,实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的 例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯 定,的二次抓的球比较多, 那么第二次黄球数目比第一次多的概率就 很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。3。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。 或者隔一定时间从新使用筛选量压一下, 我不知你是否干临床, 想想 抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。4。neo的产物是酶，过高的G4 18浓度就要有更多的neo酶来支 持,否则细胞也要被毒死的, 而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成 太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在 同一转染阳性细胞，在不同浓度的 G418 液中生长速度也不同，严重 形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的， 用米 氏方程理解吧。5。胰酶的作用不必理会，有的细