Chapter8亲和纯化

1、 第八章第八章 亲和色谱亲和色谱v生物亲和作用生物亲和作用（bioaffinity）定义：定义：生物分子能够生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。或简称亲和作用。通过亲和作用发生的结合称通过亲和作用发生的结合称特异性结合（特异性结合（specific binding）或亲和结合（）或亲和结合（affinity binding）。）。 概概 述述v亲和纯化技术亲和纯化技术定义：利用生物分子

2、间的定义：利用生物分子间的特异性结合作用（亲特异性结合作用（亲和作用和作用）的原理进行生物物质分离纯化的技术。）的原理进行生物物质分离纯化的技术。分类：分类：亲和色谱技术亲和色谱技术、亲和膜分离技术、亲和、亲和膜分离技术、亲和沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。第一节第一节 生物亲和生物亲和作用作用一、亲和作用的本质一、亲和作用的本质v参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。质。v蛋白质参与亲和作用的机理蛋白质参与亲和作用的机理一般认为蛋白质的立体结构中存

3、在结合位点，一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点，呈凹陷或凸起结构。呈凹陷或凸起结构。具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的各种相互作用，主要包括各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、静电作用、氢键力、疏水性相互作用、配位键、弱共价键疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。等。生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是亲和作用特异性高的主要原因。亲和作用特异性高的主要原因。v1.1.离子强度离子强度(I(I，氢键力，氢键力，亲和作用，亲和作用 ； II，疏水性，疏水性相互作用相互作用，亲和作用，亲和作用 ）v2.p

4、H2.pH（根据蛋白质解离基团的根据蛋白质解离基团的pKapKa值而定值而定, ,如解离基团为羧基，如解离基团为羧基，pHpH应高于其应高于其pKapKa值，带电量最高，静电作用力大，值，带电量最高，静电作用力大， pHpH严重影严重影响亲和作用，响亲和作用，存在最佳存在最佳pHpH，使亲和作用最大，使亲和作用最大 ）v3.3.抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质( (脲和盐酸胍会抑制氢键形成，亲和脲和盐酸胍会抑制氢键形成，亲和作用作用 ）v4.4.温度（温度（T T ,疏水性相互作用疏水性相互作用;静电作用、氢键力、配位静电作用、氢键力、配位键作用键作用）v5.5.离液液体离液液体（离子半径

5、大、电荷密度低的阴离子如（离子半径大、电荷密度低的阴离子如SCN-, I-SCN-, I- ，CLO4-CLO4-等减弱疏水性作用，亲和作用等减弱疏水性作用，亲和作用 ）v6.6.鳌合剂（鳌合剂（除去金属离子，影响配位键的形成，抑制亲和作除去金属离子，影响配位键的形成，抑制亲和作用用二、影响亲和作用的因素二、影响亲和作用的因素三、亲和作用体系三、亲和作用体系酶酶：底物底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；属离子；抗体抗体：抗原抗原、病毒、细胞；、病毒、细胞；激素、维生素激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；：受体蛋白、载体蛋白；外源凝集素外源凝集素：多糖、糖蛋白、

6、细胞表面受体：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；蛋白、细胞；核酸（核酸（ DNADNA和和RNA RNA ）：互补碱基链段、组蛋：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；v亲和作用体系的特异性亲和作用体系的特异性高度特异性体系高度特异性体系：一对一关系，如：一对一关系，如抗原与其单克抗原与其单克隆抗体隆抗体的结合、的结合、酶与底物酶与底物的结合。的结合。群特异性体系群特异性体系：大多数亲和体系大多数亲和体系，亲和作用不具，亲和作用不具备绝对的特异性，如外源凝集素可与任何含有糖备绝对的特异性，如外源凝集素可与任何含有糖基的蛋白质结合、酶与辅酶或金属辅基的

7、结合。基的蛋白质结合、酶与辅酶或金属辅基的结合。结合常数结合常数 LELEKeqEL EL 其中：其中：E、L和和EL分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。Keq一般为一般为104108dm3/mol，太大，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困接近不可逆结合）洗脱回收困难，太小则难于有效吸附目标物质。难，太小则难于有效吸附目标物质。结合常数越大，表示结合常数越大，表示亲和作用越强亲和作用越强在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为亲和结合对象（一般为蛋白质）的亲和结合对象（一般为蛋白质）的配基配基

8、（ligand) 配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为第二节第二节 亲和色谱原理亲和色谱原理一、原理一、原理利用键合了利用键合了亲和配基亲和配基的亲和吸附介质为固定的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，相亲和吸附目标产物，不同蛋白质分子对固不同蛋白质分子对固定化在载体上的亲和配基具有不同的识别和定化在载体上的亲和配基具有不同的识别和结合能力结合能力，根据亲和吸附作用力的差异，根据亲和吸附作用力的差异，使使目标产物得到分离纯化的液相色谱法。目标产物得到分离纯化的液相色谱法。常用的配基有抗体、抗原、常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底激素或受体蛋

9、白、酶的底物和抑制剂等物和抑制剂等v基本过程：基本过程： 固相化固相化 (ImmobiliseImmobilise)载体载体配基配基吸附吸附 (AdsorptionAdsorption)洗脱洗脱(ElutionElution )二、亲和色谱操作二、亲和色谱操作vv步骤：步骤：进样、吸附进样、吸附：含有目标产物的料液连续通过：含有目标产物的料液连续通过亲亲和色谱柱和色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透为，直至目标产物在色谱柱出口穿透为止（与固定床吸附操作相似）止（与固定床吸附操作相似）清洗清洗：用清洗液（与原料溶解液的组成相同的：用清洗液（与原料溶解液的组成相同的缓冲液）除去非特异性结合的杂蛋白

10、缓冲液）除去非特异性结合的杂蛋白 洗脱洗脱：特异结合在配体上的靶蛋白最后可用能：特异结合在配体上的靶蛋白最后可用能使其与配基解离的溶液使其与配基解离的溶液（洗脱液）洗下。（洗脱液）洗下。再生：再生：用清洗液清洗，使色谱柱的用清洗液清洗，使色谱柱的PHPH和离子强和离子强度适合于亲和吸附度适合于亲和吸附洗脱液：含配洗脱液：含配体溶液体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白进样、吸附进样、吸附清洗液清洗液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）吸附吸附清洗清洗洗脱洗脱时间时间v注意事项注意事项1.1.）当两种以上蛋白质同时被吸附时，可采用线性）当两种以上蛋白质同

11、时被吸附时，可采用线性梯度洗脱或逐次洗脱法分离梯度洗脱或逐次洗脱法分离2 2）为提高分离度，应采取较小的进料量（远低于）为提高分离度，应采取较小的进料量（远低于发生穿透所需的进料量）发生穿透所需的进料量）第三节亲和色谱介质第三节亲和色谱介质v制备亲和色谱介质的意义制备亲和色谱介质的意义：亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实现，多现，多数情况下需根据目标产物选择合适的亲和数情况下需根据目标产物选择合适的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。进行外源凝集素的亲和纯化时，无需自制亲和吸进行外源凝集素的亲和

12、纯化时，无需自制亲和吸附介质。可直接选用商品化凝胶介质（含有糖基附介质。可直接选用商品化凝胶介质（含有糖基介质）。介质）。v载体的选择载体的选择v配基的选择配基的选择亲和吸附剂及其制备方法亲和吸附剂及其制备方法（p322）载体应具备的特征载体应具备的特征：具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；粒径均一的球形粒子粒径均一的球形粒子。v载体的选择载体的选择

13、可供选择的载体可供选择的载体v琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶v聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶v葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶亲水性凝胶过滤介质均亲水性凝胶过滤介质均可作为亲和配基的载体可作为亲和配基的载体 配基应具备的特性：配基应具备的特性： 1.1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.2.必须具备能被修饰的功能基团必须具备能被修饰的功能基团v配基的选择配基的选择配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体大分子物质：酶、抗体v纯化酶的配基纯化酶的配基: :底物、抑制剂、辅酶、辅基底物、抑制剂、辅酶、辅基等；等；v纯化抗原抗

14、体的配基：互为配基纯化抗原抗体的配基：互为配基v纯化核酸的配基：纯化核酸的配基：DNADNA和和RNARNA，蛋白质和，蛋白质和mRNAmRNA固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂水的固相基质上制成固相化吸附剂 过程：载体活化过程：载体活化、接臂接臂 CNBrCNBr活化法活化法 环氧基活化法环氧基活化法 硅胶的活化硅胶的活化 接臂：在配基与载体之间连接一个接臂：在配基与载体之间连接一个“间隔臂间隔臂”，以增大小分，以增大小分子配基与在载体之间的距离子配基与在载体之间的距离, ,克服克服载体载体空间位阻空间位阻的影响，使的

15、影响，使配基与生物大分子有效亲和结合配基与生物大分子有效亲和结合v配基的固相化（亲和吸附介质）配基的固相化（亲和吸附介质）第四节亲和吸附平衡第四节亲和吸附平衡（略）（略）第五节亲和色谱过程分析第五节亲和色谱过程分析v亲和色谱操作过程亲和色谱操作过程上样吸附上样吸附清洗（洗涤）清洗（洗涤）洗脱洗脱再生再生1 1、进料吸附、进料吸附（p329)p329)亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：v亲和吸附亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合：亲和配基与目标分子间的特异性结合（选择性高）（选择性高）v非特异性吸附非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）：料液中各种

16、溶质（包括目标产物）与固定相介质和配基分子中的某些部位的疏水性和与固定相介质和配基分子中的某些部位的疏水性和静电相互作用（选择性低）静电相互作用（选择性低）v基本要求：基本要求：1 1）亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用）亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用和吸附容量和吸附容量2 2）杂质的非特异性吸附需控制在最低水平）杂质的非特异性吸附需控制在最低水平缓冲液的离子强度要适当（缓冲液的离子强度要适当（0.1-0.5mol/l)0.1-0.5mol/l)缓冲液的缓冲液的pHpH应使配基和目标产物与杂质的静电作用应使配基和目标产物与杂质的静电作用较小较小加入表面活性剂减少杂质以及目标

17、产物的非特异性加入表面活性剂减少杂质以及目标产物的非特异性疏水性吸附疏水性吸附注意事项（注意事项（p330)v样品液的浓度不宜过高样品液的浓度不宜过高v上样时流速比较慢上样时流速比较慢v样品缓冲液中有一定的的离子强度样品缓冲液中有一定的的离子强度v上样时选择适当较低的温度上样时选择适当较低的温度 2.2.清洗清洗v目的：目的：洗去色谱柱空隙和吸附剂内部存在的杂质洗去色谱柱空隙和吸附剂内部存在的杂质v清洗液：清洗液：采用采用与吸附操作相同的缓冲液与吸附操作相同的缓冲液（PH和离子和离子强度相同），必要时加入表面活性剂强度相同），必要时加入表面活性剂v清洗操作时间：清洗操作时间：根据色谱流出液的组

18、成变化情况而根据色谱流出液的组成变化情况而定，避免定，避免过度清洗过度清洗（回收率降低）或（回收率降低）或清洗不充分清洗不充分（纯度降低）纯度降低）3 3、洗脱、洗脱v特异性洗脱特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配与亲和配基或目标产物的竞争性结合基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。，脱附目标产物。v非特异性洗脱非特异性洗脱通过调节洗脱液的通过调节洗脱液的pHpH值、离子强度、离子种类值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，或温度等理化性质降低目

19、标产物的亲和作用，使之脱附，较多采用使之脱附，较多采用特异性洗脱特异性洗脱v v优点：优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。从而得到较高的分辨率。 洗脱条件温和，可避免目标产物失活洗脱条件温和，可避免目标产物失活v缺点：缺点：洗脱时间较长洗脱时间较长v改善方法：改善方法： 选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度 特异性洗脱特异性洗脱非特异性洗脱非特异性洗脱v 与配体亲和力较小时与配体亲和力较小时 连续连续大体积平衡缓冲液冲洗大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较，不影响

20、活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。大，待分离物质浓度较低。v 配体结合较强时配体结合较强时 适当的适当的pHpH、离子强度洗脱、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活，注意尽量不影响待分离物质的活性性v 与配体结合非常牢固时与配体结合非常牢固时 使用较强的使用较强的酸、碱酸、碱或在洗脱液中加入或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂脲、胍等变性剂，使，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性（需慎用）蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性（需慎用） 逐次降低洗脱液逐次降低洗脱液PHPH的非特异性洗脱的非特异性洗脱3 3、吸附剂的再生和保存、吸附剂的再生和保存 v再生再生 用大量清洗液洗涤用大量清

21、洗液洗涤 严重的不可逆吸附时，使用严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿高浓度的盐溶液、尿素等变性剂素等变性剂或加入适当的或加入适当的非专一性蛋白酶非专一性蛋白酶v保存保存 加入加入0.01%0.01%的叠氮化钠，的叠氮化钠，4 4C C 下保存下保存 亲和色谱的特点亲和色谱的特点v优点：优点：纯化过程简单、迅速；纯化过程简单、迅速；分离效率最高。分离效率最高。条件温和（适用于含量极少又不稳定的活性物质）。条件温和（适用于含量极少又不稳定的活性物质）。v缺点：缺点：必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件析的稳定条件，亲和吸附剂价

22、格昂贵，亲和吸附剂价格昂贵，其应用范围，其应用范围受到限制。受到限制。是一种高度分离纯化是一种高度分离纯化蛋白的方法，蛋白的方法，有时只用亲和色谱即可使纯度提有时只用亲和色谱即可使纯度提高高1000至至10000倍。）倍。）三、应用三、应用1.1.酶、酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离和精制酶、酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离和精制（组织纤溶酶原激活剂，干扰素，脱氢酶，淀粉酶（组织纤溶酶原激活剂，干扰素，脱氢酶，淀粉酶抑制剂，基因重组蛋白）抑制剂，基因重组蛋白） 2.2.分辨化学或遗传学上修饰的酶分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质

23、 结构研究结构研究 4.4.纯化人工合成的多肽和蛋白质纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.5.解释酶作用机理解释酶作用机理第三节第三节 亲和膜亲和膜一、原理一、原理v利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析。亲和层析。二、应用及特点二、应用及特点v应用应用：单克隆抗体的纯化、葡萄糖单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱磷酸脱氢酶（氢酶（G6PDH）的纯化等。）的纯化等。v特点特点优点优点v传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利

24、用率高；率高；v压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。缺点缺点v理论板数很低，吸附和清洗效率低；理论板数很低，吸附和清洗效率低；v膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降。寿命下降。第四节 亲和错流过滤一、原理和操作一、原理和操作v原理：原理：ACFF又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形。化技术，是亲和层析的另一种变形。v操作：进料吸附、清洗、洗脱和再生

25、等步骤。操作：进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。二、应用和特点二、应用和特点v应用：应用：如伴刀豆球蛋白（如伴刀豆球蛋白（con A）的纯化，连）的纯化，连续亲和循环提取（续亲和循环提取（CARE）纯化）纯化 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶等。等。v特点特点优点优点v以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作；化操作；v选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析；选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析；v载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快；传质阻力，目标分子的亲和结合速度快；v不

26、需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂贵、放大困难的缺点。贵、放大困难的缺点。缺点缺点v相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。 第五节第五节 其他亲和纯其他亲和纯 化技术化技术一、亲和双水相分配一、亲和双水相分配v原理：原理：利用偶联亲和配基的利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在合作用下促进目标产物在PEG相的分配，提高目标相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。产物的分配系数和选择性。v操作：操作：包括亲和分配（进料）、杂蛋白反萃取（清包括亲和分配（进料）、杂蛋白反萃取（清洗）和目标产物反萃取（洗脱）等步骤。洗）和目标产物反萃取（洗脱）等步骤。二、亲和反胶团萃取二、亲和反胶团萃取v原理：原理：在反胶团相中除通常的表面活性剂（如在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标亲和配基的助