三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究

1、三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究摘 要本论文以三种藻类海洋中药海藻、昆布、海茜为原料，采用热水回流提取的方法得到海藻粗多糖HZ1，然后采用乙醇分级沉淀的纯化方法对HZ1进行初步的纯化，得到粗褐藻胶HZ2组分和粗褐藻糖胶HZ3组分。采用硫酸苯酚的方法对HZ1进行了总糖含量的测定。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮高效液相色谱(PMP-HPLC)柱前衍生化方法对HZ1进行单糖组成分析，还用此方法测定了HZ2组分中甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的比例以及HZ3组分中岩藻糖的含量。此外，用高效凝胶渗透色谱法测定HZ3分子量。结果表明，海藻类中药多糖的理化性质既有相似又有不同，推测可能与海藻的种类、提

2、取方法、采收季节、生长年限等有关。本研究为藻类海洋中药材的质量控制和药效物质基础研究提供了初步的实验数据。关键词：海藻多糖，理化性质，PMP-HPLC柱前衍生Study on Extraction and Physicochemical Properties of three kinds of traditional marine Chinese medicinesAbstractIn this paper, three kinds of traditional marine Chinese medicines（haizao, kelp, Haiqian）were used as raw ma

3、terials. Algae were extracted with water by heat under reflux method, thus, HZ1 crude polysaccharides were acquired, then two fractions crude alginate (HZ2) and crude fucoidan (HZ3) were obtained by fractional precipitation of HZ1 with ethanol. The content of total sugar in HZ1 was determined with p

4、henol sulfate method. The monosaccharide composition using precolumn derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP); the ratio of mannuronic acid and guluronic acid in HZ2 and the content of fucose in HZ3 were also determined with this method. The molecular weight of HZ3 was measured by Ge

5、l Permeation Chromatography (GPC).Polysaccharides from different sources which are either similar or different on physicochemical properties. The composition of algal polysaccharides varies according to several factors such as species, extraction procedure, season of harvest and growth years. The re

6、sults provided data to the quality control and material base of traditional marine Chinese medicines origin from algae.Key word : Seaweed polysaccharides; Physicochemical properties; PMP-HPLC precolumn derivatization目 录1.前言12.实验部分22.1 海藻粗多糖的提取纯化22.1.1 海藻多糖的提取22.1.3 分子量的测定42.1.4 结果与讨论52.2 单糖组成分析102.2

7、.1材料与仪器102.2.2 原理与方法102.2.3 结果与讨论122.3 褐藻糖胶含量测定132.3.1 材料与仪器132.3.2 原理与方法132.3.3 结果与讨论142.4 褐藻胶MG比测定152.4.1 材料与仪器152.4.2 原理与方法152.4.3 结果与讨论162.5 小结173. 综述184. 参考文献285. 致谢31三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究1.前言海洋中药系指以传统中医药理论为指导的海洋天然药物，我国是将海洋生物用作药物最早的国家之一。现存最早的医学著作黄帝内经中就有“乌贼骨作丸，饮以鲍鱼汁治血枯”的记载。经过几千年的积淀，海洋中药已经成为传统中医药的

8、重要组成部分。中华海洋药物辞典收载海洋药物1600种，包括动物药1431种，藻类中药125种，矿物药6种，其中海藻、昆布、海茜都是常见的藻类中药，具有消痰软坚散结，利水消肿之功效，常用于治疗瘿瘤、瘰疬和痰饮水肿等。海藻中的多糖是主要的活性成分之一，报道具有增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、抗菌和抗病毒等生理活性1。研究中药海藻多糖对探讨海藻的药用物质基础具有极其重要的意义。中药海藻多糖主要由填充在细胞壁间的褐藻胶、褐藻糖胶以及褐藻淀粉三部分组成，是一类多组分混合物，三者的比例常因褐藻种类的不同而不同。褐藻胶亦称褐藻酸盐，为褐藻的胞间多糖，是由-(14)-D-甘露糖醛酸（简称M）和-(14)-L

9、-古罗糖醛酸（简称G）组成的线形多糖。其分子中主要存在聚甘露糖醛酸(Polymannuronate, PM)、聚古罗糖醛酸(Polyguluronate, PG)和G与M交替共聚的PMG三种结构片段2。褐藻胶在海蒿子中的含量为14.3%3，铜藻中褐藻酸21.3%4，在海带中含量约为19.7%，较为丰富5；褐藻糖胶亦称岩藻多糖，岩藻聚糖，是一种细胞间多糖，主要由岩藻糖构成，另外分子中可能还含有糖醛酸、乙酰基、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等；铜藻中褐藻糖胶的量为6.1%，褐藻淀粉亦称海带多糖、昆布多糖、海带淀粉、昆布淀粉，主要由-(13)-D-葡萄糖组成，其上有-(16)-D-葡

10、萄糖分支。我国褐藻中褐藻淀粉含量不多，海蒿子中褐藻淀粉的含量为0.57%，海带中的含量一般为1%左右，马尾藻中以南方产的铜藻的含量较高，提取得率约为4%6。目前对海藻多糖提取物的研究已取得一些进展，如对海藻多糖结构的研究主要集中于其所包含的糖单元及含量。本文对几种中药海藻多糖进行了提取并对部分理化性质进行了研究，以期为中药海藻多糖的药用物质基础的研究提供理论的参考。2.实验部分2.1 海藻粗多糖的提取纯化2.1.1 海藻多糖的提取2.1.1.1 实验材料及仪器实验原料：本实验作用海藻药材购于全国不同产地，加工方式为直接晾干。本文对海藻多糖粗提物中总糖含量、单糖组成以及M/G和岩藻聚糖含量进行了

11、测定，使用的海藻药材见表1.1。表1.1 实验用海藻药材中药序号原植物拉丁名批号产地海藻1海蒿子Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag.001006742福建2海蒿子Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag.100301山东3海蒿子Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag.120701山东4海蒿子Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag.20120317福建5海蒿子Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag.101009351福建6羊栖菜Sargassum fusiforme (Har

12、v.) Setch20120130温州7羊栖菜Sargassum fusiforme (Harv.) Setch201108胶南8羊栖菜Sargassum fusiforme (Harv.) Setch2012030281温州9羊栖菜Sargassum fusiforme (Harv.) Setch2012050001温州昆布10海带Laminaria japonica Aresch.20120210青岛11裙带菜Undaria pinnatifida (Harv.)Sur.20120211青岛海茜12铜藻Sargassum horneri (Turn.)C. Ag.2012080263荣成1

13、3铜藻Sargassum horneri (Turn.)C. Ag.2012050002温州岩藻糖标准品，购于美国sigma公司，乙醇、苯酚、浓硫酸、丙酮等均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司(上海)。电子分析天平 (梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)TU-1900紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)电热恒温水浴锅 (鹤壁华博电子科技有限公司)2.1.1.2 实验方法13种海藻，真空干燥箱40干燥至恒重，粉碎过40目筛，准确称取10g药材粉末，加入10倍量的水，100下冷凝回流1h，3000rpm离心10min，收集上清液，重复提取两次(首次提取前浸泡半小时)。合并提取液

14、，定容到100mL，精密量取20mL，蒸干，称重，计算粗提物产率(命名为HZ1)，其余加入95%乙醇，调节乙醇的终浓度为30%，醇沉24h，沉淀用丙酮洗涤3次，得褐藻胶粗品(命名为HZ2)，称重，计算得率，上清继续用95%乙醇，调节乙醇的终浓度为80%，醇沉24h，同样，沉淀用丙酮洗涤3次，得褐藻糖胶粗品(命名为HZ3)称重，计算得率。提取工艺流程图，如下:海藻粉末10g（40目）加10倍量水，100下回流二次每次一小时3000rpm离心10min提取液定容到100mL蒸干计算得率HZ1精密量取20mL加乙醇使醇含量达30%，静置24h，离心沉淀HZ2加乙醇使醇含量达80%，静置24h，离心H

15、Z3沉淀弃去上清图1: 海藻多糖提取流程2.1.2 粗提物总糖含量测定2.1.2.1 实验原理糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物。反应式如下：图2: 己糖脱水形成羟甲基糠醛结构糠醛或糠醛衍生物与苯酚溶液反应，生成黄至橙色化合物，在一定范围内，吸收值与糖含量呈线性关系，因此可比色测定。苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应，己糖在490nm处(戊糖或糖醛酸在480nm)有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。2.1.2.2 实验步骤(1)岩藻糖标准曲线的绘制：精密称取105干燥至恒重的岩藻糖对照品25mg于100mL的容量瓶中，配成浓度为250g/

16、mL的标准储备液，依次稀释成125、62、31、16、8g/mL的溶液，各取1.0mL加入浓硫酸2.5mL，混匀，加入0.5mL 6%苯酚溶液，100水浴15min，冷却，于490nm处测吸光度(每个浓度平行3次)。以横坐标为岩藻糖质量，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。(2)样品总糖含量测定：精确称量各样品25mg于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，配成浓度为250g/mL的供试溶液。分别取1mL于试管中加入浓硫酸2.5mL，混匀，加入0.5mL 6%苯酚溶液，100水浴15min，冷却，于490nm处测吸光度(每个样品平行测三次)。2.1.3 分子量的测定实验原理：采用凝胶渗透色谱法测定样品

17、的分子量。该方法利用高分子溶液经过多孔性凝胶柱时，在凝胶柱上按其流体力学体积大小而进行分离。分子质量大的首先被淋洗出来，分子质量小的后被淋洗出来，从而达到按其分子尺寸大小分离的目的。实验用色谱条件：色谱柱：TSK-GEL GMPWXL(7.8*300mm)流动相：0.1M Na2SO4溶液 流速：0.5mL/min柱温：35 进样量：20L样品浓度：5mg/mL，过0.22m的水膜检测器：示差折光检测器(RID)标准品：右旋糖苷，分子量依次为6000、10000、21700、48800、113000、210000、366000、805000Da将右旋糖酐标准品用流动相配成5mg/mL的溶液后，

18、依次进样，记录色谱图，利用AgiLent GPC软件处理，以右旋糖酐标准品的分子量对数(LgMw)对保留时间tR作图，建立标准曲线。将HZ3粗提物用流动相配成5mg/mL的溶液后，按照上述条件，HPLC分析，并代入标准曲线计算分子量。2.1.4 结果与讨论2.1.4.1 海藻粗多糖的提取本实验粗多糖的提取采用在100水浴冷凝回流1h，重复提取两次。利用乙醇沉淀法进行纯化。从结果来看，海蒿子粗多糖的得率从11.00%-48.98%，不同批次的海蒿子得率差异较大，羊栖菜粗多糖得率从22.97%-32.98%，得率相差较小，两批铜藻得率也相差较大，3种中药海藻粗多糖的得率大多在40%以下（3号海蒿子

19、除外）；经过纯化后HZ2占生药材的5%左右（10号样品除外，可能是由于干燥不佳的原因）；HZ3占生药材的4%左右，羊栖菜的含量比海蒿子高，海带的含量最低为1.32%，两批铜藻之间相差也较大，原因可能是由于海藻的种类、产地、采收季节、生长年限等的影响，使得不同来源的海藻及相同来源不同批次的海藻多糖得率相差较大。表2-1：不同组分粗提物得率中药序号来源HZ1HZ2HZ3占药材%占药材%占粗提物%占药材%占粗提物%海藻1海蒿子11.003.5332.072.6423.982海蒿子28.994.8516.722.408.273海蒿子48.985.3410.904.759.694海蒿子12.860.28

20、2.172.3218.055海蒿子18.732.1011.074.4423.416羊栖菜25.001.676.704.1516.627羊栖菜32.984.9114.884.9014.858羊栖菜31.006.8429.785.0816.399羊栖菜22.977.3532.002.9312.77昆布10海带27.9927.6998.941.324.7111裙带菜39.997.8136.282.576.43海茜12铜藻26.980.431.592.378.7713铜藻18.000.613.395.1928.862.1.4.2 总糖含量测定本实验采用硫酸苯酚法。在硫酸的作用下，单糖与苯酚缩合生成有色

21、化合物，在 490 nm(己糖)或 480 nm(戊糖)处有最大吸收，且吸光度和糖含量呈线性关系，吸光度可用紫外可见分光光度计检测。此法灵敏度高，稳定性强，重现性好。本实验下一步欲对褐藻糖胶含量进行测定，且结合文献报道，海藻多糖粗提物中均含有褐藻糖胶，故选取岩藻糖作为标准品，进行总糖含量的测定。图3：总糖含量测定标准曲线以岩藻糖浓度C(g/mL)为横坐标，以吸光值A 为坐标，绘制标准曲线(图3)，得回归方程y = 0.0093 x - 0.0099 ，R² = 0.9991。在岩藻糖浓度为4-62g/mL范围内，岩藻糖浓度与吸光度值成线性关系。测得样品吸光度值及计算得到的总糖含量见表

22、 2-2。表2-2 ：HZ1总糖含量测定实验结果中药序号基源总提取率%吸光度值总糖含量占粗提物%占生药材%海藻1海蒿子11.000.24110.791.192海蒿子28.990.2119.502.753海蒿子48.980.24811.085.434海蒿子12.860.43819.262.485海蒿子18.730.25111.212.106羊栖菜25.000.2149.632.417羊栖菜32.980.35315.615.158羊栖菜31.000.28312.613.919羊栖菜22.970.34115.093.47昆布10海带27.990.26411.783.3011裙带菜39.990.299

23、13.295.31海茜12铜藻26.980.1798.142.2013铜藻18.000.28512.682.28从以上数据可以看出，海藻总糖含量占粗提物的百分比在9.50-19.26之间，占生药材的百分比在1.19-5.43之间，不同批次的羊栖菜之间的差异要比海蒿子小；3种海蒿粗提物中总糖含量均在20%以下，海蒿子总糖含量占粗提物9.5%-19.26%，4号海蒿子总糖含量最高，占粗提物19.26%，占生药材1.19%-2.43%，3号海蒿子最高，为5.43%，其余批次在2%左右，羊栖菜总糖含量占粗提物9.63%-15.61%，占生药材2.41%-5.15%,含量比海蒿子高，海带、裙带菜中总糖含

24、量占粗提物的比例均在10%以上；两次铜藻总糖在粗提物中的含量有所差异，但是在生药材中的含量相差不大。 2.1.4.3 分子量测定根据所得的线性回归方程：y = -2.1282 x + 25.6738 ，R² = 0.9985，表明在保留时间13.149-17.572min范围内，多糖分子量的对数与保留时间呈较好的线性关系(如图4所示)。HZ3分子量的测定结果如表2-3。图4：分子量测定标准曲线图5: 部分海藻HZ3组分HPLC图谱：表2-3：HZ3分子量测定结果中药序号基源HZ3分子量(kDa)主要峰位分子量最小分子量最大分子量海藻1海蒿子481.82.139788.32海蒿子511

25、.32.184854.03海蒿子446.11.923164.14海蒿子127.22.116743.75海蒿子459.41.912102.86羊栖菜466.91.515026.77羊栖菜314.91.99747.98羊栖菜310.52.125810.99羊栖菜44.31.94570.8昆布10海带310.21.913485.711裙带菜301.62.112102.8海茜12铜藻506.93.244334.713铜藻473.06.235708.2由于HZ1为粗多糖，纯度较低，分子量分布没有明显的范围，因此我们选取了经过乙醇沉淀法纯化后的HZ3组分进行分子量的测定，乙醇沉淀法的原理为根据不同多糖在不

26、同浓度的乙醇中溶解度不同进行纯化，专一性不强，会把某些性质相似的褐藻胶、蛋白质等沉淀出来，因此，HZ3与HZ1相比只是褐藻胶的含量相对减少，纯度依然较差，色谱峰不对称，因此主要观察了峰位分子量并没有对D值进行计算。各样品的粗褐藻糖胶的分子量分布范围一致，在 1-90,000 kDa之间。主要峰位分子量大多在300-500kDa之间，但是4、9号样品较为特殊，原因待查。 2.2 单糖组成分析2.2.1材料与仪器仪器：AngiLent 1100 高效液相色谱仪 (美国AngiLent公司)电热恒温水浴锅 (鹤壁华博电子科技有限公司)HGC-24A氮吹仪 (上海楚定分析仪器有限公司) 1-14型台式

27、离心机 (美国Sigma公司)0.22m微孔滤膜 (天津博纳艾杰尔科技有限公司)试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) (ALaddin IndustriaL Corporation) 乙腈(色谱纯) (Burdick & Jackson)磷酸二氢钾(分析纯) (国药集团化学试剂有限公司(上海)氢氧化钠(分析纯) (国药集团化学试剂有限公司(上海)氯仿(分析纯) (莱阳经济技术开发区精细化工厂)超纯水 (miLipore company)三氟乙酸 (国药集团化学试剂有限公司(上海)单糖标准品：甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、

28、岩藻糖，均购于美国Sigma公司2.2.2 原理与方法2.2.2.1 实验原理HZ1单糖组成分析采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC测定。由于3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮( PMP) 具有强的紫外吸收, 能与还原性的糖在温和条件下反应, 不需要酸催化, 也不会引起脱唾液酸基, 产物无立体异构体, 且在245nm处有强吸收, 故采用HPLC分析PMP衍生物。应用PMP作为衍生化试剂,可以进行单糖的组成分析,检测限可以达到pmoL,同时也可以用于寡糖链的分离，纯化。反应式：2.2.2.2 色谱条件色谱柱：KromasiL-C18(150×4.6mm，5m，

29、淮安智润科技有限公司)流动相：18%(v/v)乙腈-磷酸盐缓冲液(100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠)流速：1.0mL/min检测波长：245nm柱温：35进样体积：5L2.2.2.3 实验步骤1. 多糖的水解取HZ1100mg加入5mL水，配成20mg/ mL的多糖溶液，取250L，加入250L 4M 三氟乙酸溶液，混匀，封管，110，油浴降解6h，取出，加入500L甲醇，35下氮气吹干，如此反复4次，100L水转移出，待用。2. 衍生化标记取多糖水解液100L及等摩尔混合的单糖标准品混合液100L，加入100L 0.3M NaOH溶液和100L 0.5M的PMP甲醇溶液，混匀，70水浴反应90

30、min，取出，冷却，加入100L 0.3M HCL中和，再加入500L氯仿萃取，12000rpm离心10min，弃去下层，如此反复4次，上层水相过0.22m微孔滤膜，进行HPLC分析7。2.2.3 结果与讨论本实验采用 PMP-HPLC 法对各多糖组分进行分析，此方法适合于同时分离中性、酸性和碱性单糖，灵敏度和分离效果好，不易产生立体异构产物，产物在紫外 245 nm 处有强烈吸收。图6：单糖标准品及部分样品的HPLC图谱单糖标准品 PMP 衍生物的 HPLC 分析见图6，从左到右依次是古洛糖醛酸（G）、甘露糖醛酸（M）、甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcNH2）、葡萄糖醛酸（GlcA）、鼠

31、李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Arb）、岩藻糖（Fuc）。样品单糖组成分析见表2-4(岩藻糖的百分含量定为1)。结果表明，所有海藻多糖所含单糖种类相似，主要含有G、M、Man、GlcNH2、GlcA、Gal、Glc、Xyl、Fuc，均不含Arb，G和Fuc含量较高，Rha的含量很少。表2-4：高效液相色谱法HZ1单糖组成测定中药序号基源单糖组成GMManGluNH2GluARhaGluGalXylFuc海藻1海蒿子0.561.810.530.130.4900.170.930.251.002海蒿子0.612.390.490.

32、090.3900.310.900.291.003海蒿子0.341.230.390.070.270.051.111.000.231.004海蒿子0.602.210.420.090.320.050.201.160.271.005海蒿子0.511.740.450.100.390.200.451.530.231.006羊栖菜0.522.180.570.170.480.040.751.300.311.007羊栖菜0.251.010.140.040.120.040.560.630.091.008羊栖菜0.492.040.350.070.290.020.050.810.251.009羊栖菜0.873.860

33、.360.080.290.030.200.800.221.00昆布10海带0.733.940.380.150.420.060.181.770.201.0011裙带菜0.291.330.290.110.340.070.041.110.151.00海茜12铜藻0.080.420.320.100.270.020.140.880.151.0013铜藻0.691.010.530.100.430.060.381.630.251.002.3 褐藻糖胶含量测定2.3.1 材料与仪器仪器：同2.2.1标准品：L-岩藻糖对照品（美国Sigma公司）2.3.2 原理与方法原理同2.2.2.12.2.2.3 实验步骤

34、1.多糖水解取HZ3100mg加入5mL水，配成20mg/ mL的多糖溶液，取100L，加入100L 2M 三氟乙酸溶液，混匀，封管，100，油浴降解5h，取出，加入200L甲醇，35下氮气吹干，如此反复4次，100L水转移出，待用。2.衍生化标记岩藻糖标准品溶液的衍生：取2500g/ mL的岩藻糖标准品100L，加入100L 0.3M NaOH溶液和100L 0.5M的PMP甲醇溶液，混匀，70水浴反应90min，取出，冷却，加入100L 0.3M HCL中和，再加入500L氯仿萃取，12000rpm离心10min，弃去下层，如此反复4次，上层水相过0.22m微孔滤膜，然后依次将PMP-岩藻

35、糖溶液稀释成浓度为1250、625、312、156、78、39g/ mL的溶液，进行HPLC分析。供试品溶液的衍生：取HZ3多糖水解溶液100L，按上述步骤进行衍生，进行HPLC分析。3. HPLC分析条件：色谱柱：KromasiL-C18(150×4.6mm，5m， 淮安智润科技有限公司)流动相：19%(v/v)乙腈-磷酸盐缓冲液(20mM磷酸二氢钾-氢氧化钠，PH=6.7)流速：1.0mL/min检测波长：245nm柱温：35进样体积：10L2.3.3 结果与讨论本实验采用 PMP-HPLC 法对各海藻HZ3中岩藻糖含量进行定量分析，采用外标法对各样品进行岩藻糖含量测定。以岩藻糖

36、浓度C(g/mL)为横坐标，以峰面积值Area(mAu)为坐标，绘制标准曲线(如图7所示)，得回归方程y = 12.2630 x+14.5011 ，R² = 1.0000。在岩藻糖浓度为39-1250g/mL范围内，岩藻糖浓度与峰面积值成线性关系。图7：岩藻糖含量测定标准曲线表2-5：HZ3岩藻糖含量测定结果中药序号基源HZ3(%)占HZ3(%)占HZ1%占生药材%海藻1海蒿子22.205.320.592海蒿子16.441.360.393海蒿子12.171.180.584海蒿子5.911.070.145海蒿子4.751.110.216羊栖菜8.751.450.367羊栖菜27.544

37、.091.358羊栖菜21.713.561.109羊栖菜16.542.110.49昆布10海带14.930.700.2011裙带菜12.640.810.33海茜12铜藻14.941.310.3513铜藻19.395.601.01各样品的岩藻糖含量测定结果见表2-5。结果表明，岩藻糖含量在HZ3中的百分比在4.75%-27.54%之间，占生药材的百分比在0.2%-1.10之间，其中5批海蒿子HZ3组分岩藻糖含量相差较大，4、5号海蒿子含量较低；羊栖菜HZ3组分中岩藻糖含量较高（6号样品除外）岩藻糖含量相差较大；海带、裙带菜、铜藻HZ3组分中岩藻糖含量也在15%左右。岩藻糖含量不同可能与海藻的产地

38、、采收季节、生长年限等因素有关，原因还有待于进一步研究。2.4 褐藻胶MG比测定2.4.1 材料与仪器材料与仪器：同2.2.12.4.2 原理与方法实验原理同单糖组成 2.2.2.1实验步骤：多糖的降解和衍生化标记同2.2.2.3HPLC分析方法：色谱柱：KromasiL-C18(150×4.6mm，5m， 淮安智润科技有限公司)流动相：17%(v/v)乙腈-磷酸盐缓冲液(100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠，PH=7.0)流速：0.8mL/min检测波长：245nm柱温：30进样体积：2L2.4.3 结果与讨论褐藻胶的结构现已明确，褐藻胶结构是以 M 和 G 为单体通过-1,4-糖苷键连

39、接而成的。从整个分子来看褐藻胶可以分为三种片段：即聚甘露糖醛酸(PM)片段、聚古罗糖醛酸(PG)片段和 M 与 G 交替共聚形成的片段(PMG)。本实验采用PMP-HPLC法对粗多糖提取物的30% 醇沉组分(HZ2)进行M/G的测定。部分样品的HPLC图谱见图8，实验结果如表2-6。结果表明样品的M/G范围为1.036.33，甘露糖醛酸的含量均高于古洛糖醛酸。图8：羊栖菜201108 M/G测定HPLC图谱表2-6：HZ2甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比测定中药序号基源M/G海藻1海蒿子6.332海蒿子6.043海蒿子4.934海蒿子1.035海蒿子5.196羊栖菜3.687羊栖菜5.748羊栖菜3

40、.599羊栖菜5.41昆布10海带3.2911裙带菜5.23海茜12铜藻1.0913铜藻1.56所有海藻样品甘露糖醛酸的含量均高于古罗糖醛酸，M/G值范围在 1.03 6.33之间；海藻 (海蒿子,羊栖菜)、昆布 (海带,裙带菜) 样品的M/G值比较接近（4号海蒿子样品除外）；铜藻的M/G值较低，与其他物种有较大差异。2.5 小结本论文对三种藻类海洋中药共13个样品的粗多糖进行了提取，结合乙醇分级沉淀的方法，分别获得各样品的粗多糖 HZ1、粗褐藻胶HZ2和粗褐藻糖胶HZ3，并且采用硫酸-苯酚法、PMP-HPLC法、凝胶渗透色谱法等方法，对上述多糖提取物的总糖含量、分子量分布、单糖组成、M/G比

41、值、岩藻糖含量等理化性质进行初步的比较研究。结果表明，海藻类中药多糖的理化性质既有一定的相似性，又各有所长，推测可能受物种、产地、生长时间、采收时期等多因素的影响。本研究为藻类海洋中药材的质量控制和药效物质基础研究提供了初步的实验数据。 3. 综述羊栖菜等食用海藻的含砷问题研究概述海藻是深受消费者喜爱的健康蔬菜，因含有丰富的碘、钙、铁、磷等物质，素有“天然微量元素宝库”之称。这是由于海藻具有富集海水中无机元素的能力，不但能为人类提供有益的微量元素膳食来源，而且在保护海洋和地球生态安全中起到十分重要的作用8。据估计，全球每年约有 2000 多万吨氮和 200 多万吨钾由陆地通过雨水流入海洋，海藻

42、能吸附、浓缩大海中的这些营养物质并将其转化成有机物。如果没有海藻，海水将富营养化，从而导致海洋生态和地球生态的严重恶化。但是在另一方面，由于海藻同时能富集海水中的砷等有害重金属，潜在的砷中毒问题已成为藻类食品安全的主要影响因素之一，成为人们广泛关注的焦点。砷是一种氧化应激前体和致癌物。砷对各种生物均具有急、慢毒性作用,研究表明，多数无机砷的毒性强于有机砷。无机砷的毒理作用主要是与巯基-SH 结合，抑制酶的活性，增加活性氧（ROS）引起细胞损伤，以及引起基因调控紊乱。砷对细胞的代谢具有抑制作用，影响线粒体呼吸、ATP的合成。砷还可以抑制血管的生成和微管蛋白的聚集、影响雌激素受体的活化、诱导热休克

43、蛋白的表达，并且可以引起谷胱甘肽氧化。由于砷在原子结构上与磷相似，因此砷还可以取代骨骼中的磷，从而影响骨骼的结构。有证据表明，砷可以诱导氧化应激，引起脂质过氧化，诱导基因突变和染色体畸变。砷通过影响细胞信号传导干扰基因表达，砷直接与糖皮质激素受体作用，选择性抑制其介导的转录。另外砷可以抑制 DNA 修复、改变功能基因组 DNA 甲基化状态，促进其他致突变剂的作用，增加对多种疾病的易感性9,10。海藻具有富集海水中砷元素的特性，据统计，海带、紫菜、羊栖菜等可食用海藻总砷含量在 12-108 mg/kg (干重)左右11,12,13,14，而由卫生部修订并于2005年1月25日发布的GB2762-

44、2005食品中污染物限量、GB19643-2005藻类制品卫生标准中规定藻类制品中“无机砷”限量(干重计) 1.5mg/kg。远远高于我国对食品重金属含量的管理规定，。下面对羊栖菜等食用海藻的含砷问题研究进展进行综述。3.1 海藻对砷的富集作用海藻对海水中无机元素的吸附富集作用与其组织构造有关15。海藻的细胞壁主要是由多糖、蛋白质和脂类构成的网状结构，带有一定的负电荷，且有较大的表面积与黏性；细胞膜是具有高度选择性的半透膜。这些结构特点导致藻类对铅、铜、镉、砷等高价离子的吸附容量明显高于对一般离子的吸附容量，且远高于其它海产品和陆生植物。研究表明，不同种属的藻类富集砷的能力不同。褐藻比其它藻类

45、有更高的砷吸附性能,这是因为其细胞壁多糖的主要成分藻酸盐能提供大量的羧基基 团16，而该藻酸盐和岩藻聚糖对重金属的螯合起主要作用17。据文献报 道11,12,13,14：海藻中砷的主要存在形式是以砷糖存在(>90%)还有少量的 As(III)、DMA。其中褐藻的含砷量最大，其总砷含量在20-108 mg/kg (干重)之间；大多数红藻的含砷量在18-24 mg/kg (干重)之间；大多数绿藻在12-21 mg/kg (干重)之间。藻类中砷的化学形态和含量分布特征不仅与种类有关，而且与海水砷浓度、藻体部位、生长季节等都有一定的关系11。从藻类的部位来看，从叶部到茎部，砷遍布于藻体的各个部分

46、。但一般来说，叶部砷含量高于茎部。Whyte 12等报道海囊藻(Nereocystmluetkeana)的叶部和茎部砷含量不同，叶部的有机砷和无机砷含量分别是茎部的 2倍和 5 倍。就藻类叶部的砷含量来说，基部最高，皮质高于髓质12。Martin Rose等研究发现，海带叶体分生组织中的砷分布稠密，说明有些砷化合物也许与分生组织中的新陈代谢有关18。藻类中的其它无机离子也可以影响藻类对砷的累积作用。磷酸盐与砷酸盐在吸收过程中相互竞争，磷酸盐抑制藻类对砷酸盐的吸收11。3.2 海藻中的砷元素形态特点及其生物转化近年来随着食品安全毒理评价技术的发展，人们逐渐认识到砷元素在生态环境中的毒性效应并不取

47、决于它的总水平，而是取决于它存在的形态。常见的砷化合物包括亚砷酸盐(As(III)、砷酸盐(As(V)、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)，另外还有其他更复杂的砷化合物，例如砷与有机基团结合形成砷糖(AsS)、砷脂(AsL)等(如图9所示）19,20。以砷化合物的半致死量 LD50(mg/kg)计，其毒性由大到小依次为：As(III) (14)As(V)(20) MMA(V) (200 1800) DMA(V) (200 2600) AsC(>6500) AsB(>10000)，砷与有机基团结合越多，其毒性越小10。一般认为无机砷的毒性

48、远远大于有机砷，无机砷的甲基化是砷的一种解毒机制9,10。图9：砷化合物的化学结构目前国际上普遍认为，海藻中的砷以有机态和无机态并存，其中有机砷化合物占绝大多数11，主要以砷糖（Arseno-sugars）和砷脂（Arsenolipids）两种形态存在21，毒性较小。Whyte 和Englar 分析了褐藻的海带科、翅藻科和巨藻科中的砷，发现无机砷含量为0.52.7×10- 6 mg/kg，而有机砷含量为40.389.7×10- 6mg/kg，有机砷占总砷的95 %以上，无机砷只是少数12 。Edmonds和Francesconi 也认为，大多数海藻中的砷化合物主要是有机砷1

49、3。比较特殊的是马尾藻科Sargassaceae部分海藻，其无机砷含量及占总砷的比例明显高于其他褐藻。如Sargassum muticum 的无机砷含量为20.8×10-6 mg/kg，约占总砷的38 %；日本产羊栖菜Hizikia fusiforme的无机砷含量高达71.8×10-6 mg/kg，约占总砷的58 %12 。海藻从海水中富集无机砷，进而在海藻中是经过怎样的生物转化途经生成有机砷呢？Irgolic 等22通过研究海藻Tetraselmischuii 和Daphniamagna，发现当海水中的砷酸酸盐被海藻摄取进入细胞后，砷可以取代磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆

50、碱(PC)中的磷原子或氮原子，从而进入磷脂的生物合成过程，形成一些含砷的脂类、糖类。海藻中的砷酸盐经过连续的烷基化和腺苷化过程生成了砷糖如图10所示。图10：海藻中砷脂和砷糖的合成代谢示意(Lunde,1968)63.3 海藻含砷化合物在人体内的代谢砷在机体内的代谢是一个复杂的过程。代谢过程一般为：As (V) As (III) MMA(V) MMA(III) DMA(V) 随尿排出9（如图11所示）。无机砷和 MMA 的甲基转移酶以 As(III)而不是以 As(V)作为反应底物，因此进入体内的As(V)首先被还原为As(III)，部分有机砷在体内也可转变为三价砷后，再进入甲基化循环23。三

51、价砷(包括三价的无机砷 In-As 和有机砷 Or-As)易与巯基(-SH)结合形成稳定的络合物，经人体吸收后不易排泄，而累积致毒。一次摄入砷化合物，10天内可排出 90%，肾脏是砷及其代谢物的主要排泄器官，代谢产物主要为小分子甲基砷化合物，其中 DMA 占 75%左右24。但当摄入量超过排泄量时，砷就会在骨骼、肾、肝、肺、角化组织等部位蓄积而引起慢性砷中毒，潜伏期可达几年甚至几十年之久。海藻中有机砷 C-As 键结合牢固，在人体内不能分解又不易积累，被原封不动地从粪便中排泄出体外14。此外，海藻富含的硒元素对砷的毒性有拮抗作用。人体服食海藻后，硒能与砷和谷胱甘肽结合，并以硒/砷/谷胱甘肽复合

52、物的形式通过胆汁排泄25。图11：无机砷在生物体内的转化路径143.4羊栖菜的含砷问题及脱砷方法研究羊栖菜sargassum fusiforme (harv.) stech属褐藻门马尾科马尾藻属植物，在我国分布很广，北起辽东半岛、山东，南至浙江、福建和广东浅海及滩头均有生长，在浙江沿海则表现为优势种26，是一种重要的经济海藻资源。 羊栖菜入药在我国已有久远的历史，南齐陶弘景所著神农本草经上记载了羊栖菜并描述了食疗性质和利用方法。明朝药学家李时珍在本草纲目上也记载了羊栖菜的药学价值。羊栖菜主治瘿瘤结气、利小便；治疗奔豚气、脚气、水气浮肿、宿食不消等。现代研究表明，羊栖菜藻体含有丰富的多糖、食物纤

53、维素、B族维生素、褐藻酸、甘露醇，含有人体必需的矿物质和14种重要微量元素及人体必需的18种氨基酸。食用羊栖菜可防治高血压、便秘、肥胖、衰老、甲状腺机能障碍，对促进儿童发育，增强智力，恢复大脑疲劳，保持毛发光泽、皮肤润滑，增强人体免疫力，抑制肿瘤细胞生长，促进机体活力等都有很好的药疗作用。特别是羊栖菜对肥胖症、糖尿病、动脉硬化症、大肠癌等现代“文明病”有很好的预防作用。但是无论药用还是食用，羊栖菜的砷含量超标已成为严重的问题。有研究表明，羊栖菜无机砷含量达到20.87 mg/kg (以干重计)27。而由卫生部修订并于2005年1月25日发布的GB2762-2005食品中污染物限量、GB19643-2005藻类制品卫生标准中规定藻类制品中“无机砷”限量(干重计) 1.5mg/kg。如何对羊栖菜进行脱砷处理，使之符合国家食品卫生标准，这已成为羊栖菜产业需要迫切解决的关键问题。张燕平等28将干品羊栖菜原料在水中浸泡2小时后清洗、沥干后，在60-100条件下浸泡上述羊栖菜2-8小时，处理后的羊栖菜清洗后低温烘干，经过处理后的羊栖菜的脱砷率能达到85%-94%。脱砷之后的羊栖菜在营养物质方面上没有明显的被破坏，口感没有发生很大的变化，只是脱砷之后的羊栖菜产品更软 29。郑