菌种来源(上)

1、第二章：菌种选育q 菌种来源 生物物质产生菌的筛选生物物质产生菌的筛选 微生物选择性分离的原理和发展微生物选择性分离的原理和发展 重要工业微生物的分离重要工业微生物的分离q 菌种选育、分子育种 自然选育 诱变育种 抗噬菌体菌株的选育 杂交育种 原生质体融合技术 DNA重组技术q 菌种保藏 放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累

2、产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌微生物（包括动

3、、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第一节第一节 菌种的来源菌种的来源 2.1 2.1 生物物质产生菌的筛选生物物质产生菌的筛选2.1.l 2.1.l 微生物微生物生物产物的来源生物产物的来源 微生物现在和将来微生物现在和将来都是具有各种生物活性的新产物的丰富资源丰富资源。这一章的目的目的是要研究如何如何才能筛选到筛选到具有所需生物特性的新产物新产物。除了初级代谢产物

4、初级代谢产物，如氨基酸和维生素外，微生物还用于生产许多次级代谢产物次级代谢产物。筛选这类产物筛选这类产物的两个成两个成功要素功要素在于1 1）微生物（产生菌）微生物（产生菌）的选择；2 2）采用什么样的筛选方案筛选方案（检测系统）。 选择筛选方法有两个要点即选择性选择性和和灵敏度灵敏度。 2.1.2 待筛选样品的性质待筛选样品的性质q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长2.l.3 2.l.3 筛选方案的设计筛选方案的设计基本上可利用以下三种不同

5、的筛选方法三种不同的筛选方法1 1）整体生物；）整体生物；2 2）完整细胞；）完整细胞；3 3）亚细胞制剂）亚细胞制剂。2.2 2.2 微生物选择性分离的原理和发展微生物选择性分离的原理和发展 在过去40年间曾筛选筛选出许多产生新的有用的次级代谢物的菌种菌种。这些菌种多半是以经验式的筛选经验式的筛选方法获得的。大多数的抗生素均由放线菌纲放线菌纲产生。下面介绍放线菌纲为主的分离方分离方法原理法原理和发展。选择性分离方法选择性分离方法大致可分为五个步骤五个步骤： 含微生物材料的选择；材料的预处理材料的预处理；所需菌种的分离菌种的分离；培养培养；菌落的选择和纯化菌落的选择和纯化。以上任何一个阶段都可

6、引入选择压选择压力力。如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：2.2.1 含微生物材料的选择含微生物材料的选择 q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等2.2.1 含微生物材料的选择含微生物材料的选择 另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的微生物类群。 我们对海洋微生物类群的知识仍有限。 在富盐环境中存在着一类尚待开发的放线菌。 在酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的

7、有很大的不同。利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。 自然环境的菌群可因人类的活动而改变。 更新的生态环境有待开发。迄今，仍很少人从厌氧微生物中筛选次级代谢产物。 2.2.2 材料的预处理材料的预处理 为了提高分离效率提高分离效率，设计了各种处理材料的方法。 通常采用热处理方法热处理方法减少材料中的细菌数，这种作用的基础仍不清楚，但许多放线菌的繁殖体繁殖体，孢子（如链霉菌）和菌菌丝片段丝片段（如红球菌）比比G G（）细菌细胞耐热（）细菌细胞耐热。加热虽然能减少细菌同放线菌的比例，但也常减少放线菌的数目。 通常采用膜过滤法膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜置于培养基的表面，放置几

8、个小时后移去，或一直留在上面。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响，如处理放线菌繁殖体含量很低的海水，有人先将样品离心然后才过滤。 2.2.3 2.2.3 所需菌种的分离所需菌种的分离 分离的效率效率取决于培养基其养分，培养基其养分，pHpH和加入的和加入的选择性抑制剂选择性抑制剂。 表表2 23 3列举了分离放线菌的各种培养基配方。一般凭经验凭经验而不是绝对性选择。 其中广泛应用的三种培养基（其成分完全不同）即几丁质琼脂，淀粉一酪素培养基和几丁质琼脂，淀粉一酪素培养基和M M3 3培养基培养基。 因大多数放线菌都是嗜中性的嗜中性的，分离培养基的pHpH常在常在6.76.77.57.5之间之间

9、。如要分离嗜酸放线菌嗜酸放线菌，pHpH宜宜降低到降低到4.54.55.05.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌嗜碱链霉菌，它不能生长在低于不能生长在低于pH 6.lpH 6.l6.86.8的条的条件下件下。估计嗜碱性放线菌也可能存在于其它碱性环境中。 在分离培养基中广泛采用加入抗生素的方法，来增加选择性增加选择性见表24。在筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素抗真菌抗生素。这种抗生素对放线菌无作用。2.2.4 2.2.4 菌种的培养菌种的培养 放线菌分离平板通常在25253030培养。嗜嗜热菌热菌在45455555，而嗜冷菌嗜冷菌在410410。主要的变变量量是培养的时间。分离嗜温菌嗜

10、温菌如链霉菌和小单孢菌一般培养7 71414天天。嗜热菌嗜热菌，如高温放线菌只需l l2 2天天。除非延长培养时间，有可能漏掉新的漏掉新的或不寻常的菌株。因此，有人在3030和和4040将培养时间延长到1 1个月个月，结果分离出一些不寻常的种属。也有人在200培养培养6 6周周从海水中获得放线菌。 定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。2.2.5 2.2.5 菌落的选择菌落的选择应采用什么方法什么方法取决于筛选的最终目的目的。常用以下两种筛选方法两种筛选方法：（l l）铺

11、菌法铺菌法 于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法订用来测定各个菌落的抗生素生产能力。（2 2）复印平板法复印平板法 将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。用丝绒等把琼脂平板上的菌落转移到别的琼脂平板上的方法。用来检测与营养缺陷性和抗药性等有关的突变体。在检测营养缺陷性时，首先在完全培养基琼脂平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上，丝绒绷在一个圆柱的光滑顶面上（圆柱的直径应比培养皿稍小），再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。因为需要某特定营养物的菌落在合成培养基琼脂平板上不能生长，所以和原来平板上的菌落相比较，就可以很容易地检测出营养缺陷

12、型菌株。 这两种方法都有缺点缺点。铺菌法铺菌法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上一种试验菌。菌落复印平板法菌落复印平板法对不长孢子的链霉菌则不能使不长孢子的链霉菌则不能使用用，也不适用于游动细菌的筛选游动细菌的筛选。因而，需要设计一种更为有效的筛选新菌种的方法。2.3 2.3 重要工业微生物的分离重要工业微生物的分离 筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶第一个阶段是分离段是分离。分离分离是指获得纯的或混合的培养物。接着筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。 可以设计出一种在分离阶段便能识别所需菌种识别所需菌种的方法的方法。 也有用特定的分离方法随后再去识别所需生产

13、随后再去识别所需生产菌株。菌株。值得注意的是，我们要求获得高产菌株高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程生产过程时的经济问题经济问题。工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求在筛选所需菌株时宜考虑的一些重要指标重要指标：（1 1）菌的营养特征菌的营养特征，在发酵过程中，常会遇到要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料，一般用含有这种成分的分离培养基便筛选出

14、能适应这种养分的菌种。（2 2）菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于4040的菌种的菌种，这可以大大降低大规模发酵的冷却成本。（3 3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性。菌对所采用的设备和生产过程的适应性。（4 4）菌的稳定性菌的稳定性。（5 5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度。菌的产物得率和产物在培养液中的浓度。 （6 6）容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。 （3 3）（6 6）是用来衡量分离得到的菌种的生产性生产性能能，如能满足这几条便有希望成为效益高效益高的生产菌种。但在投入生产之前还必须对其产物的毒性，和菌种的生产物的毒性，和菌种的生产性能作出评价。

15、产性能作出评价。 以上所述菌种有些必须从自然环境中分离得到。但若是工业微生物学者也可从菌种保藏委员会菌种保藏委员会中索取。尽管购买菌种的性能一般比较弱，但可作为模型来改良和发展分析技术发展分析技术，然后再用于评定天然分离株评定天然分离株。 理想的分离步骤是从土壤环境分离步骤是从土壤环境开始的，土壤中富于各种所需的菌。设计的分离步骤应有利于具有工业重要特性的菌的生长，如加入某些对其他类型菌生长不利的化合物或采用选择性培养条件选择性培养条件。 2.3.l 2.3.l 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 A A 富集液体培养富集液体培养 富集培养富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的

16、一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件。通过把富集培养物富集培养物接种到新鲜的同一种培养基可以重新建立选择压力重新建立选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。这里，移种的时间是关键时间是关键，应在所需菌种占优势的情况下移种。 用连续培养用连续培养，通过改变限制性基质浓度限制性基质浓度可以控制控制两种菌的比生长速率比生长速率， 用连续富集技术分离用于连续发酵生产用于连续发酵生产的菌种特别适合特别适合。因用分批富集培养分批富集培养和在固体培养基上纯化的方法固体培养基上纯化的方法分离得到的菌株在连续培养中的表现很差表现很差。B B

17、固体培养基的使用固体培养基的使用 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白。产生一清晰圈。清晰圈的大小不能完全作为不能完全作为选择高产菌的依据。因在沉浸培养中碱性蛋白酶的单位与因在沉浸培养中碱性蛋白酶的单位与平板上的圈的大小之间不成比例。平板上的圈的大小之间不成比例。2.3.2 2.3.2 随机分离方法随机分离方法 有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处。因此，常随机地分离随机地分离所需菌种，并为此发展了一些快速筛选方法快速筛选方法和归纳出高产培养基成分和归纳出高产培养基成分的选择准则选择准则如下：l）制备一系列的培养基，其中有各种类型

18、的养分各种类型的养分成为生长限制生长限制因素因素（即C、N、P、O）；2）使用一聚合或复合形式聚合或复合形式的生长限制养分生长限制养分； 3）避免使用容易同化的碳或氮，它们可能引起分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏； 指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。的底物的有关酶合成的现象。 4）确定含有所需含有所需的辅因子辅因子（Co 2Mg 2十十、Mn 2、Fe 2）；5）加入缓冲液以减少减少pHpH变化变化。A A 抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选 把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上

19、含有试验菌的平板上可以鉴定产生菌的抗微生物作用。也可以将微生物分离株生长在液体培养基液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性抗菌活性。使用液体培养基作为初筛初筛具有可以避免在琼脂上培养与沉浸培养的不一致不一致，但其工作需要更大的空间和设施。采用联合试验菌采用联合试验菌， 用一种很专一的筛选技术专一的筛选技术可以检出新的抗菌药物抗菌药物。B B 药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选 筛选能抑制人们代谢某下个关键酶关键酶的微生物产物的原理：是一种化合物例如能在体外抑制一关键人体酶体外抑制一关键人体酶，它可能在体内具有药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动物作实验，可筛选出新的药理活性化合

20、物。C C 生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸的生产不能作为分离步骤中的选选择压力择压力，可用随机办法分离产生菌随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检筛选试验检出产生菌出产生菌。通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌检出生长因子产生菌。D D 多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选 曾从各种环境中分离出多糖产生菌多糖产生菌，有人认为制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。从这种环境获得的分离株，可在适当的培养基中生长。并可从菌落的粘液状外观识别这类产生菌。 经自然界分离、筛选获得的有价值的菌种有价值的菌种，在用于工业生

21、产之前必须经人工选育以得到具一定生产能力的菌种。特别是用于医药上的抗生素，还需通过一系列的安全试验安全试验及临床试验及临床试验，以确定是否是一种有效而安全的新药。有效而安全的新药。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土

22、样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分

23、析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。 2002,陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to

24、 enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 7381菌种选育目的q 提高生产能力提高生产能力q 提高产品质量提高产品质量q 开发新产品开

25、发新产品q 解决生产实际问题解决生产实际问题q 防止菌种退化防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程一一 、 自然选育自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突自然突变变而进行菌种筛选菌种筛选的过程叫做自然选育自然选育。 所谓自然突变自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因两个原因：即多多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂多因素低剂量的诱变效应量的诱变效应，是指自然突变实质上自然突变实质上是由一些原因不详的低低剂量诱变因素剂量诱变因素引起的长

26、期综合效应。所谓互变异构效应互变异构效应是指四种碱基的第六位第六位上的酮基和氨基酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式酮式和氨基式。碱基对发生自然突变的机率约为机率约为10108 8一一10109 9。第二节第二节 自然选育和诱变育种自然选育和诱变育种自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为退和生产质量的下降，这种突变成为负突变负突变。另一种是我

27、们生产上希望看到的，对生产有利，这种突另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为变成为正突变正突变。一、自然选育一、自然选育自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。重要措施。回复突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变突变问题：问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？进一步

28、选育或保藏进一步选育或保藏移种生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子斜面种子(初筛初筛)高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产试验生产试验自然选育流程图自然选育流程图为何进行复为何进行复筛？筛？筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。二、诱变育种二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突

29、变进行的筛选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理：紫外，快中子物理：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍诱变育种步骤q出发菌株的选择q处理菌悬液的制备q诱变处理q中间培养q分离和筛选出发菌株的选择 1.选择纯种 2. 平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不同，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。 3.有良好的代谢特性 4.选择对诱变剂敏感的菌株。 5.选用多个出发菌株进行诱变收效较较快。 诱变剂的选择诱变剂的选择 1.野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。

30、 2.遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。3.要考虑诱变剂的作用机理来选择诱变剂，两种诱变剂复合使用效果好。4.最适剂量(有2种观点)：杀菌率90%99%较好，甚至99.9%;杀菌率75%85%。 突变株的筛选（Selection）I.随机筛选 ( (Random selection)1)摇瓶筛选法 初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。 复杂、耗时 2)

31、琼脂块筛选法 简单、快速，但不准确II.定向筛选 ( (Oriented selection)筛选形态突变株 筛选营养缺陷型突变株 营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。基本培养基(MM)： 能满足野生型菌株正常生长的培养基补充培养基(SM)：在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基完全培养基(CM)：能满足各种营养缺陷型生长的称培养基筛选营养缺陷型的步骤筛选营养缺陷型的步骤v诱变v淘汰野生型v检出缺陷型v确定生长谱淘汰野生型抗生素法：由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素

32、，杀死活化状态的野生型，保存了休眠状态的缺陷型细菌青霉素，酵母制霉菌素菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法 生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。以

33、不同组合的营养混合物与融化凉至50的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在56个平皿上可测20株菌以上。介绍几种物理、化学诱变剂的使用方法介绍几种物理、化学诱变剂的使用方法A 紫外线紫外线 紫外线是一种使用时间较久、值得推广的诱变剂，它的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，故应用最广泛，研究得也最多。虽然紫外线的波长范围很宽，但对诱变最有效的波长仅仅是波长仅仅是260 nm左右（左右（253265）nm一般诱变时用菌（孢子）悬浮液进行处理，紫外一般诱变时用菌（孢子）悬浮液进行处理

34、，紫外灯的功率为灯的功率为15W，距离固定在，距离固定在30 cm左右。左右。 紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。 B 快中子快中子 中子是原子核的组成部分、是不带电荷的粒子不带电荷的粒子，可由回旋加速器回旋加速器、静电加速器静电加速器或原子反应堆产生原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核能使吸收中子的物质的原子核射出质子来射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成质子造成的。受中子照射的物质所射出的质子是不不定向的定向的，照射后产生的电离，则集中在受照射物体内沿着质子的轨迹上沿着质子的轨迹上

35、。中子分为快中子和慢中子快中子和慢中子。快中子的能量为0.210百万电子伏特百万电子伏特，慢中子的能量为l40100电子伏特。慢中子的效应同射线、射线、射线和电子等照射射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、射线具有较大的电离密电离密度度因而能更多地引起点突变和染色体畸变。剂量范围约为剂量范围约为1001500戈戈。快中子在诱变育种中有较好的效果，近年来圉内已广泛应用。由于剂量测量还不统一，不同反应堆或其他中子源所放射的快中子能量亦不同。因此，诱变结果也很不一致，为此，国际原子能组织已提倡推广标准化的照射装置。C氮芥氮芥 氮芥是一种极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用它的

36、盐酸盐盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制诱变机制是它能引起染色体畸染色体畸变变，氮芥盐酸盐在碳酸氢钠溶液中呈游离状态，甘氨甘氨酸能与氮芥（在碳酸氢钠参与下）结合，形成无毒化酸能与氮芥（在碳酸氢钠参与下）结合，形成无毒化合物合物，因此它有解毒作用。氮芥使用方法：氮芥使用方法：D 亚硝酸亚硝酸 亚硝酸是一种常用的有效诱变剂有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基脱去碱基中的氨基。例如A、C、G分别被脱去氨基而成为次黄嘌呤（次黄嘌呤（H）、尿嘧啶（）、尿嘧啶（U）、黄嘌呤）、黄嘌呤（）等。复制时，它们分别与分别与C、A、C配对配对。前两种情况可以引起碱基对的转换而造成突变。此外，亚硝酸还会引起DNA两条链之间的交联而造成两条链之间的交联而造成DNA结构上的缺失结构上的缺