解钾菌的分离、鉴定及解钾能力

1、解钾菌的分离、鉴定及解钾能力【摘要】：p ：为了开发高效微生物解钾肥，利用解钾菌选择培养基，从陕西省周至县猕猴桃园农田土壤中分离出具有解钾能力的菌株共计12株，通过纯化培养，筛选出1株高效解钾菌JK3。利用16S rDNA基因序列分析p 方法对该菌株的分类信息进行鉴定，鉴定结果表明该菌株为胶质芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），并通过试验确定该菌株的最适培养条件：初始接种量1.5%，摇床转速20_r/min，培养温度30 ，初始pH值为7，最佳碳为糖蜜，最佳氮为麸皮。试验结果可为解钾菌JK3的大规模工业化生产提供数据支持。【关键词】：p ：解钾菌；分离；筛选；鉴

2、定；最适条件中图分类号： S182 文献标志码： A文章编号：1002-1302（20_）11-0471-04钾是植物生长所必需的三大营养元素之一，一般植物体内含钾量占干物质质量的0.3%0.5%1。钾的营养功能主要表现于钾能激活多种酶的活性，目前已知的多种酶需要一价阳离子活化，其中钾离子是植物体内最有效的激活剂；钾能促进光合作用，提高二氧化碳的同化率；钾可促进作物体内物质的合成与转运2；钾能维持细胞膨压，促进植物生长，植物各种正常代谢过程都需要细胞维持正常的结构和形态，而细胞的正常结构和形态的维持又需要一定的渗透压，钾离子和氯离子正是维持植物细胞渗透压的主要离子；钾能增强植物抗逆性3，钾也能

3、增强作物抗寒、抗旱、抗高温、抗病、抗盐、抗倒伏等的能力，从而提高其抵抗外界环境的忍耐能力。然而，随着种植业结构的调整，农作物产量和复种指数的不断提高，土壤中的耗钾量不断增加，全国耕地土壤速效钾含量以2 mg/kg速度下降，南方各地土壤缺钾情况更为严重4-5。一方面，我国可溶性钾矿资严重匾乏，国家每年花巨额外汇进口钾肥仍难以满足农业上对钾肥的需要6-7。另一方面，土壤自身含有大量的含钾矿物，只是它们主要以稳定的硅铝酸盐形式存在，其钾不能为作物吸收利用8。土壤中的含钾硅酸盐矿物只有在理化因素和微生物的作用下，通过分化和分解逐步释放出钾，供作物生长利用。因此，利用微生物降解含钾矿物就显得尤为重要9。

4、国内外的研究表明，目前发现的解钾菌株多为胶质芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）10-11，其在生物菌肥、生物冶金及污水处理方面有着广泛的应用前景12，因此，胶质芽孢杆菌的研究受到广泛关注。本试验以钾长石粉作为唯一钾，通过选择性培养，从猕猴桃大田土壤中分离出12株解钾细菌，并通过分离、纯化、复筛，得到1株解钾能力较强的细菌JK3，研究该菌株的生理生化特征及它对钾长石粉的降解特性，确定菌株的最适接种量、最适pH值、最适生长温度及溶氧量对解钾能力的影响，旨在确定该菌株的生长情况及解钾能力，为开发新的成本低、效果好且不污染环境的解钾菌，充分利用土壤中的钾素资提供科学依据

5、，对发展绿色农业具有十分重要的意义。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样 土样采自陕西省西安市周至县猕猴桃园土壤，土样采集方法为5点采样法，去除表层土壤，用土钻取深度为020 cm的土壤，将5个不同点的土样混合为1份，装入无菌样品采集袋，标签注明采样信息，放入4 冰箱保存。1.1.2 矿样 钾长石粉过100目筛，然后用无菌水浸泡3 d，除去水溶性钾13。1.1.3 培养基 分离培养基14：蔗糖5.0 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 5 g，琼脂20 g，去离子水1.0 L，pH值7.27.5，121 灭菌20 min。选择培养基：蔗糖

6、5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，FeCl3 0.005 g，钾长石粉1.0 g，琼脂20 g，去离子水 1.0 L，pH值7.27.5，121 灭菌20 min。1.2 方法1.2.1 解钾菌的富集 取3支250 mL锥形瓶，各装入含无机盐液体培养基100 mL，向锥形瓶中分别加入1 g土壤样品，摇床培养3 d（温度30 ，转速180 r/min），吸取锥形瓶底部菌液进行转接，富集解钾菌，每次转接前将菌液涂布到平板上计数。1.2.2 解钾菌的初筛 将富集培养基中的菌种转接到含钾长石无机盐培养基的平板上，置于30 恒温培养箱中，出现菌落后，挑取单菌

7、落转接至新的固体培养基上，重复上述操作3次，将单菌落放入冰箱保存备用。1.2.3 解钾菌的复筛 将初筛出的菌株转接到装有100 mL钾长石液体培养基中，恒温培养3 d，涂布，记录菌数，同时检测钾长石的降解，在菌液中加入4 mL H2O2，121 消解 30 min，4 000 r/min离心5 min1，取上清液，定容至100 mL，以不接菌处理为对照，用火焰分光光度计测量速效钾含量，筛选出1株生长旺盛、降解能力强的菌株。1.2.4 菌株形态学及生理生化特征 将分离纯化得到的菌株在固体平板上进行划线培养，在温度为30 的条件下培养2 d，观察菌株生长状况及菌落特征。1.2.5 菌株16S rD

8、NA序列分析p 及比对 选用细菌16S rDNA通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）、1 492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）建立PCR扩增体系进行扩增。PCR反应体系（50 L）：5×One Taq Standard Reaction Buffer 10 L，10 mmol/L dNTPs 1 L，10 mol/L Forward Primer 1 L，10 mol/L Reverse Primer 1 L，One Taq DNA Polymerase 1 L，Template DNA 2.0 L，Nuclease-Free Water 34 L。扩增程序：94 预变性10 min；94 变性30 s，65 退火30 s，72 延伸1 min，共30个循