钙蛋白酶与阿尔茨海默病关系的研究进展

1、钙蛋白酶与阿尔茨海默病关系的研究进展【关键词】阿尔茨海默病tau蛋白质类淀粉样b蛋白细胞凋亡综述(文献类型)钙蛋白酶是一种胞内ca2+依赖性的、水解半胱氨酸的蛋 白酶家族1 2,通过特异性蛋白水解酶作用调节多种酶和 蛋白质的功能，包括信号传导分子和细胞骨架蛋白等，在细 胞活动、信号传导、稳定细胞骨架结构等方面发挥作用。钙 蛋白酶在神经系统广泛分布，阿尔茨海默病(ad)是一种慢性 进行性神经系统退行性疾病，临床特点为进行性痴呆，表现 为智力、记忆力、定向力、推理和判断能力等不可逆性退化; 主要病理改变为大量的b 淀粉样蛋白(b amyloidprote in, a b )沉积形成的神经炎性斑块、

2、过度磷酸化的tau蛋白聚 集形成的神经原纤维缠结(neurof ibrillarytan gle,nft)以 及选择性的神经元丧失。近期研究表明，钙蛋白酶功能失调 可能在ad的发病过程中发挥重要作用。笔者就钙蛋白酶的 结构、活性调节以及在ad的nft和a b病理形成中的作用做 一综述。1钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的结构钙蛋白酶的结构至今已证实钙蛋白酶家族成员有14个 3 o钙蛋白酶i和钙蛋白酶ii是研究最多的2类钙蛋白酶 超家族成员，它们的区别主要在于体外激活时所需ca2+浓度 不同，后者在纯化状态下，需要毫摩尔浓度ca2+才有最佳活 性，而前者在微摩尔浓度ca2+即可有最佳活性。钙蛋白酶由

3、1个大亚基(80kd)和1个小亚基(30kd)组成异二聚体。大亚 基有4个结构域(i、ii、iil iv)：结构域i位于n 末 端,ca2+与酶结合后，结构域i可发生自我水解，引起蛋白酶 构象改变；结构域ii是蛋白酶活性区，有木瓜蛋白酶样的结 构，由cysl05、hi s262、asn2863个氨基酸残基组成酶的活 性中心；结构域iii是抑制蛋白或激活蛋白结合的部位；结构 域iv是ca2+结合的部位。小亚基有2个结构域,结构域i富 含甘氨酸和疏水氨基酸，是酶与细胞膜结合的部位；结构域 ii与大亚基结构域iv结构相似，也含有ca2+结合位点。钙蛋白酶抑制蛋白的结构钙蛋白酶抑制蛋白是一特异 性内源

4、性抑制剂蛋白，与钙蛋白酶共存，构成钙蛋白酶/钙蛋 白酶抑制蛋白系统，起负性调节作用。典型的钙蛋白酶抑制 蛋白分子有5个结构域，i区为氨基末端，iiv区均含有同 源性序列 thr lie pro pro x tyr arg(x 代表 任何一种氨基酸)，是对钙蛋白酶起抑制作用的关键部位，为 抑制区。2钙蛋白酶活性的调节钙蛋白酶以一种无活性的酶原形式存在，构成酶活性中 心的氨基酸残基(cysl05, his262, asn28 6)彼此分离，无法形 成酶活性中心，蛋白酶的激活需要通过构象的改变，使残基 相互接近形成酶活性中心。钙蛋白酶的激活钙蛋白酶活性受到严格调控，其中ca2+ 的作用最为重要。细胞

5、内游离ca2+浓度（ca2+i）升高使钙 蛋白酶大亚基结构域1自我水解，构象改变，形成酶活性中 心，表现出蛋白酶活性45 o钙蛋白酶在膜上的定位也是调节其活性的重要机制，早 期研究认为，钙蛋白酶一旦与质膜结合，即可由非活性状态 转变成活性状态，然而其他研究表明，钙蛋白酶i与钙蛋白 酶ii在自我水解前即有活性。通过与膜相互作用使钙蛋白酶 在膜上被活化，钙蛋白酶即进入胞质并能抵御钙蛋白酶抑制 蛋白的抑制作用。活化的钙蛋白酶可在膜上或胞质降解底物 蛋白68。钙蛋白酶自我水解所需的c a2+浓度与表现酶蛋白水解 活性所需要的ca2+浓度相近却比活细胞中ca2+i水平要高 得多。如何启动激活钙蛋白酶？解

6、决矛盾的办法在于发现了 磷脂的存在。在磷脂酰肌醇存在情况下，激活钙蛋白酶所需 的ca2+浓度大为降低。钙蛋白酶的磷酸化调节研究表明，钙蛋白酶序列内含有 许多磷酸化作用位点，钙蛋白酶i有9个磷酸化位点，钙蛋白 酶ii有8个磷酸化位点，这些磷酸化位点均位于80kd亚基上 9,并主要集中于两个区域：结构域i和ii结合处（ila）及 结构域ii氨基末端（lib ）。上皮生长因子（egf ）刺激细胞通 过erk/m ap激酶信号通路来激活钙蛋白酶10,通过上皮生长因子信号通路激活的钙蛋白酶又可被蛋白激酶a的磷酸化 作用所抑制1112 o钙蛋白酶活化蛋白与活性的负调节1987年pontremoli 报道,

7、isovaleryl carnitine可降低钙蛋白酶ii发挥最大催 化活性所需的ca2+浓度，同时可使其活性增加倍，但不降低 钙蛋白酶i发挥最大催化活性所需的ca2+浓度或者增加活 性。此后mel loni等从小鼠的骨骼肌细胞中分离得到一也具 有相似作用的热稳定多肽cal painactivato r0此后研究表 明calp ainactivator是相对分子质量30kd的二聚体，其氨 基酸顺序及功能均与羊肝脏蛋白uk11 4 一样。钙蛋白酶抑制蛋白可识别钙蛋白酶与钙结合形成的构 象变化，并与之特异结合。当钙蛋白酶被ca 2+激活后，如果 附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，后者将与钙蛋白酶特异结合

8、 而抑制其活性，从而保证钙蛋白酶对底物只进行特定部位的 水解。钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶的结合需要ca2+,并且 这种结合是可逆的，即在无钙离子时重新分离。3钙蛋白酶与adad的病因、病理非常复杂，涉及遗传、环境，生物、物理、 化学等诸因素，因而迄今为止，其发病机制仍不清楚，钙平衡 紊乱是发病机制的重要假说之一 131 4 o钙蛋白酶的激活促进细胞骨架的瓦解和nft的形成在ad 发病早期，与钙平衡紊乱相关的钙蛋白酶系统就已被激活, 在轴突丧失、神经元退化以及tau蛋白异常磷酸化出现之前, 特定区域的钙蛋白酶的活性就已升高。此外，在ad病人的脑 组织中观察到活性形式的钙蛋白酶就位于nft和神经毡

9、丝处 15,因此在ad中钙蛋白酶早期活化很可能促成了细胞骨架 的裂解和神经纤维缠结的形成。钙蛋白酶的激活直接参与微管相关蛋白的降解微管相 关蛋白在神经元细胞骨架中通过与微管蛋白的相互作用，影 响微管的聚合、稳定以及微管的动力学特性，微管相关蛋白 (microt ubule associ atedproteins , map)依据相对分子 质量的大小划分为：高相对分子质量蛋白map1a、m ap1b. map2a和m ap2b,中相对分子质量蛋白map2c和tau。map2、 tau都是钙蛋白酶的特异性底物。fif re等在原代培养皮层 神经元中加入a b证实了活化的钙蛋白酶可以降解map2 a

10、、 map2b、map2 c150 fang等分别用不同浓度cac12溶液孵 育wistar大鼠脑皮质匀浆液，并用蛋白质印迹和定量图像分 析技术检测不同亚型钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用，发现 一定浓度的ca2+可同时激活钙蛋白酶i和钙蛋白酶ii,这两 种亚型钙蛋白酶均参与降解tau蛋白，但钙蛋白酶ii的作用 比钙蛋白酶i更强16。钙蛋白酶的激活与细胞骨架的过度磷酸化nft是ad特 征性的病变之一，其主要成分是双螺旋丝(pairedhel icalfilament s,phf),而过度磷酸化的tau蛋白是phf的主 要亚单位，活化的钙蛋白酶可以通过调节激酶活性或者信号 传导通路引起tau、nf

11、(neurofil aments)等细胞骨架蛋白的 过度磷酸化。过度磷酸化的tau蛋白无法结合微管蛋白，从 而阻断微管蛋白的组装，抑制微管聚集，使微管解体及细胞 骨架破坏。同时过度磷酸化的tau蛋白对钙蛋白酶的水解具 有高度的拮抗能力。福建医科大学学报xx年5月第41卷第 3期林智颖等：钙蛋白酶通过tau蛋白激酶ii (tauproteink inase ii ,tpk ii ) /细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindepend entkinase 5, cdk5)途径使tau蛋白过度磷酸化。tpkii/ cdk5是脯氨酸依赖性的丝/苏氨酸(ser/th r)蛋白激酶，调节 亚基非周期素蛋白p

12、35是其特异的激动剂。在兴奋性刺激(如 脑缺血、h202、兴奋性氨基酸)、ab、自由基、氧化应激及 其他应激刺激下，经过钙蛋白酶作用，p 35能在竣基末端第 208位裂解成p25和另一大小为10kd片段,p25具备激活cdk5 的功能。由于p25/cdk5缺乏膜锚定信号基序，致使p25 /cdk5 在细胞内定位发生改变，持续性地磷酸化其适宜底物，引发 病理性改变1719 o此外，钙蛋白酶可以通过erk/mapk途径使细胞骨架蛋白 过度磷酸化。veera nna发现在原代培养的海马和小脑颗粒 神经元中，ca2+内流活化了钙蛋白酶和erkk 2并使nf磷酸 化增加，抑制erkl、2活性或特异性地抑

13、制它上游激酶mek1、 2可明显地减少nf的磷酸化20。用钙蛋白酶的抑制剂c alpeptin可阻断e rkl. 2活化和nf的过度磷酸化，由此可 以证明钙蛋白酶是erkl. 2通路的上游激动剂并很可能部分 介导了 nf和tau蛋白的磷酸化。钙蛋白酶与ab的沉积ab在脑内沉积形成神经炎性斑 块是ad的病理特征之一。ab是由b淀粉样前体蛋白(b amyl oidprecursor protein, app)经内源性蛋白水解产生的。 b 和y 分泌酶参与淀粉样酶切过程，b 分泌酶首先在 ab结构域的n端进行切割，释放出较长的可溶性app片段 (solubl eapp b ,sapp b),而 c

14、端的片段(c terminalfrag ment,ctf)仍然与膜结合，随后y 分泌酶水 解ctf b，产生了一系列长短不等的ab (3旷43个氨基酸) 和ctf y,其中有病理意义的是a 3 40和ab 42。另外，ct分泌酶和y 分泌酶参与非淀粉样酶切过程，a 分泌酶 在ab结构域之内水解app,阻断了完整的a b生成。由于ab 和y 分泌酶均与钙蛋白酶无关，故认为钙蛋白酶并 未直接参与b 淀粉样蛋白的生成。然而在ad病人脑组织 中发现ca2+、钙蛋白酶ii浓度均增高，由钙蛋白酶i水解生 成的7678kd片段也明显增多，因此也有人推测异常活性的 钙蛋白酶可能通过pkc途径影响a b的分泌3

15、 o钙蛋白酶与ad神经元凋亡的调控ad中神经元的丧失与 凋亡有关，钙蛋白酶可能参与神经元凋亡的调控。ray等用 h202及a23187诱导细胞氧化应激及ca2 +增高可使pc12细 胞凋亡，而用选择性钙蛋白酶抑制剂可阻断68kd神经纤维蛋 白的降解及细胞凋亡的发生，表明钙蛋白酶参与了pc12细胞 的凋亡21 o钙蛋白酶可能通过水解钙调磷酸酶使之活化参与凋亡 基因的调控。ray等用h202及a23187诱导pc12细胞凋亡时, baxmrna的表达无显著变化，而bel 2mr na表达水平下降, 导致b ax/bcl 2比率增高，而用细胞膜通透性选择性钙蛋 白酶抑制剂mdl28 170可抑制ba

16、x/bc 12比率增高，表明钙蛋白酶可能通过提高细胞内b ax/bcl 2表达的比率，促 进细胞凋亡21。此外，wang等实验表明钙调磷酸酶可以使 bad去磷酸化，去磷酸化bad从胞质转移至线粒体，并在此与 bel 2、bel x结合促进细胞色素c释放，从而激活 caspase途径导致细胞凋亡22。那么由它们各自调节的凋 亡通路之间是否有关联？ liu等发现ad脑中钙调磷酸酶的a 亚基在lys50 1位置可被钙蛋白酶水解而激活23 o wu等在 用海人藻酸(ka)和谷氨酸诱导的2种神经兴奋性模型中发现 激活的钙蛋白酶可以裂解cain/cabinl (钙调磷酸酶的一种 内源性抑制剂)，从而激活钙

17、调磷酸酶的活性，并引发钙调磷 酸酶介导的细胞凋亡2 4。以上研究结果说明，钙蛋白酶可 以通过水解钙调磷酸酶使之活化，并可能在兴奋性毒性所致 的神经细胞凋亡中起关键作用。钙蛋白酶以酶原形式存在，只有在其他调节因子作用下, 改变酶自身构象才能被激活。在生理状态下，钙蛋白酶通过 特异性水解修饰调节多种酶的活性，从而发挥自己在细胞活 动、信号传导、稳定结构等方面的作用。但是当其功能异常 时，可以导致多种疾病的发生。在ad,钙蛋白酶在细胞骨架的 裂解和nft的形成中起重要作用，并可能与神经炎性斑块的 形成有关，因此针对钙蛋白酶及其调节因子的药物有望在治 疗ad中发挥有效作用。【参考文献】 1satok,

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