Illumina平台测序原理及常见测序文库构建-文档资料

1、Illumina 平台测序原理及常见几平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介种测序文库构建流程简介1目目录录2第一部分：测序测序原理与流第一部分：测序测序原理与流程程 简介简介3文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeqHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace1-8 samples1-8 samplesDNA4Illumina 测序流程测序流程文库构建文库构建( 6 hrs)cBotHiSeq25001-8 samplesMiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8

2、samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpaceDNA5文库构建流程文库构建流程片段片段化化 DNA末端补末端补平平3加加A接头连接头连接接PCR6高质量DNA文库结构文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同Index Sequencing Primer7文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeqHCS/RTA

3、 ICS MSRCASAVABaseSpace8测序芯片 (Flow Cell)简介flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头)在flow cell上进行cluster簇生成9仪器简介仪器简介单条单条DNA 模板模板约约1000条条DNA模板的模板的 拷贝拷贝cBotHiSeq Sequen ncceerr35个循环的桥式PCR10cBot 工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交：将单链DNA模板杂交

4、到Flow Cell 上 第一链合成：以Flow Cell 表面上的oligos为引物，合成第一链桥式PCR：冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR线性化：将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除阻断3OH：防止在后续测序过程中继续延伸DNA链杂交测序引物11DNA模板杂交和一链合成接头序接头序列列5-3 延延伸伸含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链12新合成的链原始模板链双链DNA变性丢弃原始模板链丢弃原始模板链模板链

5、被冲洗走新合成的链留在FlowCell 上13桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥”以接头为引物进行扩增14桥式PCR扩增15变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子16第二轮桥式PCR扩增17完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR18线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的 切割位点19线性化切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链20阻断阻断3 OH21杂交Read 1 引物Read1 测序引 物将测序引物杂交到文库的接头上22Illumina 测序流程测序流程HiSeq2000 HiSeq2500 GA II

6、xMiSeqHCS/RTAICS MSRCASAVABaseSpace文库构建文库构建( 6 hrs)cBot HiSeq25001-8 samplesMiSeq1-8 samples23进行Read1 测序杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序HiSeq SBS 测序流程24HiSeq SBS 测序流程123Paired End Turnaround25Sequencing By Synthesis，SBS测序原理4种种 Fl-NTPs +聚合酶聚合酶拍照，收集信号拍照

7、，收集信号去阻断，切除荧光基去阻断，切除荧光基团团X 36 - 15126可逆终止化学反应一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子)准确度高可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信号 去阻断，切除荧 光基团下一个碱基合成27100 MicronsClusters28已完成测序合成的片段Blocked 3-ends变性掉已完成测序合成的 片段恢复被阻断的3 OHPaired End Turnround29形成形成的的 桥桥5-3延延伸伸桥式PCR5-3延伸Paired End Turnround30形成的形成的双双 链的链的桥桥Paired End Turnround31模板模板链链Paired E

8、nd Turnround等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链32新合成新合成的的 链链3 -OH阻阻断断Read2测序测序引引 物物Paired End Turnround线性化，3 -OH阻断杂交Read2测序引物33Sequencing By Synthesis 2nd ReadX 36 - 1514种种 Fl-NTPs + 聚聚 合酶合酶拍照，收集信号拍照，收集信号去阻断，切除荧光基去阻断，切除荧光基团团34Illumina 测序流程测序流程HCS/RTA ICS MSRCASAVABaseSpace文库构建文库构建( 6 hrs)cBot

9、HiSeq25001-8 samplesMiSeqHiSeq2000 HiSeq25001-8 samplesGA IIxMiSeq35第二部分：常见文库构建流程第二部分：常见文库构建流程简简 介介36文库分类DNA类文库类文库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR-Free文库简化基因组文库、单细胞样本 文库等RNA类文库类文库 转录组文库 表达谱（RNA-Seq） Small RNA37DNA小片段文库小片段文库 DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库（200bp,350bp,500bp） DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、人重测序，动植物、

10、微生物的微生物的de novo和重测序，和重测序，16s rRNA测序，测序， 宏基因组测序宏基因组测序等项目类型的文库构建。38DNA小片段建库流程39DNA小片段建库流程40DNA小片段建库流程41DNA小片段建库流程42DNA大片段文库大片段文库 DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired） 文库 片段长度大于1K bp。 主要用于动植物，微生物的动植物，微生物的de novo 测序测序43DNA大片段文库建库流程44DNA大片段文库建库流程45为什么要建大片段文为什么要建大片段文库库46Exon文库人类外显子组总共约30Mb，占全 部人类基因组约1%。外显子具有高度的保守型

11、，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。外显子测序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。Exon文库主要用于人全外显子人全外显子测测 序序和目标区域测序目标区域测序47Exon文库流程48外显子捕获方式 液相杂液相杂交交 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。49Exon测序特测序特点点 优点：1、 与全基因组测序相比，外 显子测序具有测序覆盖度更深、 数据准确性更高、花费成本更 低等优势，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。 不足：1、与全基因组测序相比，不能 检测到基

12、因组内较大的结构性 变异。2、与转录组测序相比，不能检 测到新的基因。50PCR-Free文库文库 PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过 程中不需要进行PCR的文库。 主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高，PCR扩增困难的样本；PCR产物。 不足： 所需的样本起始量较多。51PCR-Free文库与普通文库比较52简化基因组简化基因组(RAD-seq )文库文库 RAD-seq 即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异 标记（SNPs）信息的技术 与传统技术相比，该类技术操作简单

13、、不受参考基因组限 制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs 的分子标记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别 是适合大样本量的分析。53简化基因组文库建库流简化基因组文库建库流程程54转录组文转录组文库库真核生真核生物物原核生原核生物物总总RNA利用利用Oligo (dT)富富 集集mRNA去去除除 rRNA随机引物六聚体反随机引物六聚体反转转 录合成录合成cDNA末端修复，加末端修复，加A，加加 接头后接头后PCR扩扩增增Illumina 测测序序将将mRNA 随机打断随机打断成成200 nt转录组测序的研究对 象为特定细胞在某一 功能状态下所能转录 出来的所有mRNA。应

14、用：转录本的种类和基因 定量基因的转录结构可变剪切发现新的转录本55链特异性转录组建链特异性转录组建库库 使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发 现新的基因。 很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。56常规转录组建库方法基础上，在合成第二条cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后降 解含dU的DNA单链。链特异性转录组建链特异性转录组建库库57均均一化一化（DSN）建库建库方法：方法：构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处 理，然后PCR

15、再次出库。目的：目的：减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。DSN酶酶：双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能够选 择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。58RNA-Seq 是用来研究某一生 物对象在特定生物 过程中基因表达差 异的技术，具有定 量准、可重复性高、检测范围宽、成 本低等特点。真核生真核生物物原核生原核生物物总总RNA利用利用Oligo (dT)富富集集 mRNA去去除除 rRNA随机引物六聚体反转录随机引物六聚体反转录合合 成成cDNA末端修复，加末端修复，加A，加接头加接头后后PCR扩扩增增Illumina 测测序序将将mRNA 随机打断随机打断成成200 nt59RNA-Seq 与常规转录组区别与常规转录组区别RNA-Se