丙泊酚对不同TRPV1激动剂导致内脏痛的矛盾作用

1、丙泊酚对不同TRPV1激动剂导致内脏痛的矛盾作用丙泊酚是一种广泛使用的静脉麻醉剂, 静脉注射时有很高的几率出现注射痛,表明它具有致痛作用。然而, 在几个研究中 , 表明丙泊酚具有抗伤害作用。研究显示丙泊酚降低初级感觉神经传入纤维的神经兴奋性。在福尔马林实验的相和相 , 局部注射丙泊酚产生剂量依赖性的抗伤害效果。另一项实验证实 , 联合注射丙泊酚可以抑制蜂毒导致的疼痛行为。在小鼠的腹腔内注射丙泊酚 , 可以抑制醋酸导致的扭体反应, 该机制被证实是通过脊髓途径介导的。辣椒素受体 , 又名瞬时感受器电位香草酸1 亚型 (transient receptorpotentialvanilloidsubt

2、ype-1,TRPV1),在疼痛的信号传递中扮演着十分重要的作用 , 并且在小鼠的炎症性热痛觉过敏的发展中是不可或缺的一环, 激活TRPV1是内脏痛中非常重要的步骤。使用 TRPV1拮抗剂或者对新生小鼠注射辣椒素的办法来清除TRPV1神经元 , 都能抑制之后使用醋酸导致的扭体反应。包括内皮素、前列腺素和缓激肽在内的一系列因子, 主要通过蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)或者蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)途径的磷酸化来敏化 TRPV1。研究证实 , 丙泊酚增强脊髓背根神经节细胞对辣椒素的敏感性 , 是通过瞬时感受器电位锚蛋白 1 亚型 (tra

3、nsient receptor potentialankyrin receptor subtype-1, TRPA1)和 PKCs介导的 TRPV1磷酸化实现的。从理论上推理 , 腹腔内联合注射丙泊酚和TRPV1激动剂会因为丙泊酚对TRPV1的敏化作用导致内脏痛增强, 而这又和之前研究证实的丙泊酚抗伤害作用相矛盾。因此 , 我们在小鼠腹腔内注射丙泊酚联合醋酸或辣椒素, 观察其伤害反应来研究这一效果。1 材料和方法 1.1 实验动物动物本研究均选用鼠龄6-8 周, 雄性 C57BL/6J 小鼠 , 体重 20-22g, 购置于中山大学医学院实验动物中心 ( 中国 , 广州 ) 。小鼠饲养于无特定

4、病原体 (specefic pathogen free, SPF)自动调温、调湿的动物实验室中 ,自由饮水、进食 , 一天内 12 h 光照 , 室温控制在 22±1, 自由饮食 , 饲养环境为12h 昼夜节律变换 , 湿度控制在 50%-70%的环境中。本研究中实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求 , 并严格按照规定减少动物痛苦, 尽可能减少实验动物的使用数量。 1.2 实验材料丙泊酚 (2,6- 二异丙基苯酚 ) 和辣椒素都购置于Sigma 公司 ( 美国 , 密苏里州 , 圣路易斯 ), 并溶解于二甲亚砜 (dimethylsulfoxide,

5、 DMSO)作为贮存溶液。醋酸和硫酸镁购置于杭州化学试剂公司( 中国 , 浙江 ) 。所有的药物在使用前都经过生理盐水稀释。1.3 腹腔内注射醋酸、 硫酸镁和辣椒素引起的疼痛行为学观察小鼠于实验前放置于透明有机玻璃盒 (22 cm×12 cm×10 cm)内预适应 30min。 30min 后从盒子里取出 , 用胰岛素注射针 (30G 针头 ) 腹腔注射 0.01ml/g 的 0.6%醋酸和 5mM丙泊酚的混合溶液 ( 对照组 2.5% DMSO+0.01ml/g的 0.6%醋酸 ) 、0.6mg/g 的 6mg/ml 硫酸镁和 5mM丙泊酚的混合溶液 ( 对照组 2.5%

6、DMSO+0.6mg/g的 6mg/ml 硫酸镁 ) 或者200uM辣椒素与 5mM丙泊酚的混合溶液 ( 对照组 4.5% DMSO+200uM辣椒素 ), 腹腔注射药物后立即放入有机玻璃盒内进行观察, 整个过程要注意减少对动物的刺激,特别是腹腔注射动作要轻柔, 以免刺激小鼠致其活动量减少, 影响行为学的观察。观察并用手动计数器记录每只动物腹腔注射醋酸和硫酸镁混合溶液后30mmin内小鼠扭体反应的次数 ( 如腹部收缩、扭动躯干、弓背、伸展后肢等) 和用秒表计时器记录腹腔注射辣椒素后10min 内小鼠伤害反应的总时间( 如低头弯腰缩成团的姿势、腹部朝上卧倒的姿势) 。一只动物只作一次实验, 每组

7、有 10 只小鼠。一次同时观察 4 只小鼠 , 处理组和对照组各2 只。为尽可能减小昼夜时间因素对小鼠相关行为的影响, 本研究中所有动物行为学实验均在9：00 至 17：00之间进行。1.4 去除 TRPV1神经元小鼠的制备雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素 (50 mg/kg),对照组注射同样容量的溶剂(PBS含 10%ethanol与 10% Tween-80), 动物在 SPF动物房里面饲养 6 周后进行实验。新生期注射辣椒素能够去除表达 TRPV1神经元 , 用角膜刺激实验验证去除 TRPV1神经元的效果 ,用 0.01%辣椒素 20 ul 喷到小鼠眼睛上 , 小鼠会

8、用前肢拂拭眼睛 , 记数 1 min 内用前肢拂拭眼睛的次数 , 如 1 min 内用前肢拂拭眼睛的次数少于5 次就认为已经成功去除 TRPV1神经元。1.5 统计分析使用 Windows版 Minitab 16(美国 , 宾夕法尼亚州 ,Minitab公司 ) 进行统计学分析。所有数据以均数±标准差(x ±s) 表示 , 正态分布且方差齐时 ,行独立样本 t 检验 ,P<0.05认为有统计学显著差异。2 结果 2.1 腹腔内联合注射丙泊酚增加醋酸引起的扭体反应使用2mM的丙泊酚联合总量为 0.01ml/g的 0.6%醋酸在小鼠腹腔内注射后发现, 与单独注射0

9、.01ml/g 的 0.6%醋酸相比 , 每 5 分钟的扭体反应数量没有差距, 而 30 分钟内实验组总体的小鼠扭体反应比对照组要高, 分别为 53.5+9.2 次和 40.3 ± 3.6 次(P=0.02) 。但是两组之间在发生扭体反应的潜伏期上没有统计学差异, 分别为141± 10 秒和 116±8 秒 ,(P=0.47) 。腹腔内注射 5mM丙泊酚不引起小鼠的伤害反应。腹腔内注射0.6%醋酸引起小鼠 30 分钟内 31± 6.9 次的扭体反应 , 并且潜伏期少于 2 分钟。我们的观察证实了注射醋酸后的扭体反应主要发生在30 分钟内。联合注射5mM丙

10、泊酚和 0.6%醋酸使小鼠 30 分钟内的扭体反应增加到42.8 ±9.2 次(P<0.05)。2.2 腹腔内联合注射丙泊酚增加硫酸镁引起的扭体反应腹腔内注射6mg/ml硫酸镁 0.6mg/g 引起小鼠 30 分钟内 13.7 ± 2.9次的扭体反应 , 联合注射 5mM丙泊酚后 , 使小鼠 30 分钟内的扭体反应增加到 25.3±4.8 次 (P<0.001) 。2.3 腹腔内联合注射丙泊酚减少辣椒素导致的伤害反应时间腹腔内注射200M辣椒素后10 秒内导致小鼠的伤害反应时间为 371±82.7秒, 这些反应 10 分钟后消

11、失。腹腔内联合注射 200 M辣椒素和 5mmM丙泊酚后 , 小鼠的伤害反应时间大幅度缩短至 67±39 秒(P<0.05)。2.4 TRPVl 对腹腔内联合注射丙泊酚的影响为了明确 TRPVl对丙泊酚在致痛物质引起的小鼠伤害反应中的作用, 给出生 2 天的小鼠皮下注射 50mg/kg 辣椒素 , 当它们成年后再腹腔内注射醋酸、硫酸镁或者辣椒素。经过辣椒素处理后的成年小鼠, 腹腔内注射 6mg/ml 硫酸镁和 200 M辣椒素后没有任何的腹部向上卧倒或者低头弯腰坐立的伤害反应；腹腔内注射0.6%醋酸后 ,30 分钟内的扭体反应为20±4.1 次 , 显著少于对

12、照组经过溶媒处理后成年小鼠腹腔内注射0.6%醋酸后 30 分钟内的扭体反应33± 5.8 次；腹腔内联合注射5mM丙泊酚和 0.6%醋酸后 ,30 分钟内的扭体反应为16± 3.9 次, 显著少于单纯注射 0.6%醋酸后 30 分钟内的扭体反应21±3.6 次。本研究中腹腔内联合注射丙泊酚时 , 醋酸诱导的扭体反应增加, 表明丙泊酚具有促伤害作用。已有研究证实 , 腹腔内注射醋酸主要通过TRPV1介导导致扭体反应。所以,经大剂量辣椒素处理清除了TRPV1的新生小鼠成年后 , 向其腹腔内注射醋酸导致的扭体反应显著减少。TRPV1是一种依赖钙离子的非选择性阳离子通道,

13、 可以被辣椒素、质子、阳离子、伤害性温度刺激和包括脂质代谢产物在内的内源性配体直接激活。在包括内皮素和缓激肽在内的 “炎症池”物质联合作用下 , 可以降低 TRPV1的激活阈值。从小静脉注射丙泊酚时 , 经常导致注射痛 , 缓激肽和前列腺素在其中发挥重要的作用。对大鼠背根神经节感觉神经元使用较大剂量的TRPV1激动剂导致TRPV1的敏感性下降 , 而丙泊酚可以通过PKC 和 TRPA1途径使其敏感性恢复。在基因敲除 B1 和 B2 的小鼠中 , 醋酸导致的内脏伤害反应大约减少70%。可见 , 丙泊酚也许是通过敏化TRPV1增强了醋酸的伤害作用。然而 , 很难解释相同剂量的丙泊酚会减弱辣椒素的伤

14、害反应。一些研究证实 ,全身注射大剂量的丙泊酚在导致正常反射消失外, 还会产生止痛作用 , 而全身注射亚催眠剂量的丙泊酚会产生致痛作用。腹腔内注射亚催眠剂量的丙泊酚, 或者侧脑室和中脑导水管周围灰质腹外侧区注射微量的丙泊酚会产生显著的致痛作用, 这一结论已通过清醒大鼠的热板痛觉实验和福尔马林实验所证实, 而椎管内注射丙泊酚显示出良好的止痛作用。因此 , 人们认为丙泊酚通过脊髓上机制产生致痛作用。热板痛觉试验表明 , 小鼠腹腔内注射丙泊酚产生抗伤害作用, 而醋酸导致的小鼠扭体反应是通过N-甲基 -D- 天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)和 - 氨基 -3-

15、 羟基 -5- 甲基 -4- 异恶唑丙酸 ( -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)途径完成的。联合注射丙泊酚可以抑制蜂毒导致的疼痛反应。综上所述 , 丙泊酚使用的剂量和途径决定了产生止痛作用还是致痛作用。与之前的研究不同 , 我们的研究发现 , 腹腔内联合注射相同剂量的丙泊酚同时表现出致痛作用和止痛作用。它增加了醋酸和硫酸镁导致的扭体反应, 同时也降低了辣椒素导致的伤害时间。我们的研究显示 , 经过辣椒素处理的新生小鼠, 成年后联合注射丙泊酚和醋酸的扭体反应减少 , 与丙泊酚的 TRPV1作用有关。丙泊酚鼻内输注导

16、致的疼痛反应和动脉内注射导致的屈肌反射都是由TRPA1介导的。只有表达 TRPA1的神经元 , 丙泊酚才能引起内向电流, 而对于转染了 TRPV1的 HEK293细胞 , 丙泊酚并不能引起内向电流。有研究表明 , 丙泊酚不能改变辣椒素和TRPV1的结合反应。然而 , 另一个研究证明 , 丙泊酚使转染了 Wistar 大鼠 TRPV1cDNA的 HEK293细胞内钙离子浓度升高。对于转染了人 TRPV1 cDNA的 HEK293细胞 , 联合使用辣椒素和丙泊酚的内向电流反而比单独使用辣椒素的内向电流小。这些研究都表明丙泊酚和TRPV1之间有着功能上的关联。某些激动剂直接与TRPV1结合的同时 , 也起到强化介质的作用。 例如 , 轻微的酸性环境能降低TRPV1的温度阈值并增强热刺激和辣椒素导致的电流。鸡的 TRPV1对辣椒素不敏感 , 但是高浓度的辣椒素可以增强质子激发的电流。当不同物质对同一受体的结合位点有重合时, 会导致竞争性拮抗 , 例如 , 阳离子和质子都作用于 TRPV1上的 E600 和 E648 区域。镁离子在 1-10mM的环境下敏化 TRPV1,在 5-10mM的环境下阻止了TRPV1与质子的反应。丙泊酚可能在细胞膜内和TRPV1发生作用 , 或者与 TR