HPLC测定苦黄颗粒中苦参碱的含量

1、HPLC 测定苦黄颗粒中苦参碱的含量摘 要：目的 建立苦黄颗粒中苦参碱含量的HPLC 测定法。 方法采用高效液相色谱法。氨基柱（4.6 mm×250 mm，5m）；乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3），流速1.0 mLmin-1，检测波长为203 nm，柱温35，进样量5 L。 结果 测得线性范围0.2060-0.4120g (r=0.999 9)，平均回收率为100.6%，RSD 为1.76%（n=6）。结论 本方法简便可行，重现性好，结果可靠，可用于苦黄颗粒的质量控制。关键词：HPLC ；苦黄颗粒；苦参碱Determination of Matrine in Ku

2、huang Granules by HPLCWang Chun-fang1，Dong Wei2，(1. Wang Chun-fang, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210009, China; 2.Dong Wei , Lei Yunshang Pharmaceutical Limited Company, Suzhou 215009,China)Abstract :Objective To establish an HPLC method for the determination of matrine

3、 in Kuhuang Granules. Methods HPLC method was adopted. The determination was performed on a Inertsil NH2 column（4.6 mm×250 mm，5m） using acetonitrile-absolute ethylalcohol -3 phosphoric acid（32:5:3）as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength was 203 nm. Colu

4、mn temperature was 35 . The injection volumn was 5 L.Results There was a good linearity within the range of 0.2060-0.4120g(r=0.999 9). The average recovery was 100.6%, RSD=1.76%( n5). Conclusion This method was proved to be simple, accurate and can be used for quality control of Kuhuang Granules.Key

5、 words: HPLC; Kuhuang Granules; matrine 目录II苦参为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait.）的干燥根,始载于 神农本草经，列为中品。性味苦寒，归心、肝、胃、 大肠、膀胱经。具有清热燥湿,杀虫,利尿作用。用于热痢,便血，黄疸尿闭，赤白带下,阴肿阴痒,湿疹,湿疮,皮肤瘙痒,疥癣麻风；外治滴虫性阴道炎1。苦参中主要含生物碱类成分,同时还含黄酮类，醌类等成分。现代药理研究表明，其主要有效成分苦参碱（matrine)具有杀虫抗菌、保肝、抗肿瘤、抗心律失常等多种药理作2。苦黄颗粒是由雷允上制药有限公司生产的苦黄注射液改剂型而成的新药, 由苦参

6、、 大黄、柴胡等 5 味中药组成, 具有清热利湿, 疏肝退黄的功效, 主治湿热黄疸, 适用于因湿热内蕴引起的黄疸型病毒性肝炎患者的退黄3。苦参是苦黄颗粒中的主药，而苦参碱是苦参的主要有效成分，所以苦参碱是苦黄颗粒药品质量控制的指标性成分之一。现行质量标准是采用酸碱滴定法测定苦黄颗粒中苦参碱的含量,该法操作繁琐，专属性差，灵敏度低，准确度低，有待提高与创新。目前，苦参碱及其制剂的含量测定方法较多, 如两相滴定法、 高效薄层色谱法、薄层色谱 - 荧光熄灭法、毛细管电泳法等4-7, 其中 HPLC 法最为常用。该法具有操作简便、快速、准确等优点，且符合2010版中国药典精神。为有效控制苦黄颗粒药品质

7、量，根据处方中所含药味的化学成分及剂型特点, 参考中国药典2010年版中一部苦参药材测定方法及相关苦参碱含量测定的文献资料, 本文决定采用高效液相色谱法对苦黄颗粒中苦参碱的含量进行测定，为现行质量标准的提高和修订提供依据。1仪器与试药1.1 仪器日本岛津LC-20AD自动进样高效液相色谱仪；岛津UV-2401PC型紫外分光光度计；AE200型电子天平，容量瓶、移液管经过校验。1.2 试药苦参碱对照品为中国药品生物制品检定所提供（批号:110805-200508），苦黄颗粒( 3批)为苏州雷允上药业有限公司所生产 (批号:KC14003、LC14001、LC14002)，乙腈为色谱纯，水为二次重

8、蒸馏水,其它试剂均为分析纯。2方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：氨基柱Alltima Amino（250mm×4.6mm，5m）；流动相：乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3）；检测波长：203 nm（图1为苦参碱标准品扣除空白后获得的紫外光谱图）；柱温：35；流速：1.0ml·min- 1；进样量：5L。理论塔板数以苦参碱峰计不低于4000。注：波长确定写清楚过程。用什么方法，标准品浓度是多少，多少波长范围扫描！图1 流动相的紫外分光扫描图2.2 对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱对照品约5mg，置10 mL 容量瓶中, 加流动相溶解

9、并稀释至刻度, 制成对照品储备液(每1 mL 中含苦参碱 0.50 mg)。再精密吸取对照品储备液1 mL, 置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度, 摇匀，即得苦参碱对照品溶液(每1 mL 中含苦参碱 50 g)。2.3 供试品溶液的制备将苦黄颗粒研磨成粉末，取粉末约1g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中, 加氨试液1mL，润湿，加三氯甲烷50mL, 密塞, 称定重量。加热回流30min, 取出, 放冷, 再称定重量, 用三氯甲烷补足减失的重量, 摇匀,滤过，滤液蒸干，用流动相溶解残渣，转移至25 mL 容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 m）滤过, 续滤液作为供试品溶

10、液。2.4 阴性供试品溶液的制备按照供试品（苦黄颗粒）处方制备不含有苦参的颗粒作为阴性对照品，取此阴性对照品粉末约1 g，精密称定，按“2.3”供试品溶液的制备项下方法制备，得阴性对照品溶液。2.5 系统适应性试验分别吸取上述3种溶液各5L注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，在本系统条件下未见干扰物质的影响，苦参碱的保留时间约为7.0 min，以苦参碱峰计算理论塔板数为7000。见图24。图2 苦参碱对照品的HPLC图图3 苦黄颗粒供试品的HPLC图图4 阴性供试品的HPLC图3. 方法学考察3.1 线性关系试验 精密称取苦参碱对照品溶液5.15mg，置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻

11、度。分别吸取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml溶液至10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。以进样的苦参碱浓度（g/ml）为横坐标，峰面积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程方程为：Y=2256685.4X+1608.3（r=-0.9999），结果表明苦参碱浓度在41.2-82.4g·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。（见表1、图5）表1 标准曲线测定结果编号 浓度(g/ml) 峰面积 1 41.2 4686652 51.5 5839353 61.8 7003304 72.1 8127905 82.4 930509 3.2 精密度试验 精密吸取同一苦参碱对照品溶液5 L，按上

12、述色谱条件重复进样5次，测得峰面积RSD%=0.20%，表明仪器精密度良好。结果见表2。表2 精密度试验结果编号 苦参碱峰面积 平均峰面积 RSD(% )1 584750 2 5835663 581929 583325 0.20344 5823075 5840733.3 稳定性试验 取同一批号的苦黄颗粒（批号：KC14003），按“2.3”的制备方法，制备成供试品溶液,置室温下，依上述色谱条件，过 1小时、2小时、4小时、8小时进行测定。结果供试品溶液峰面积RSD为118（n=5），表明样品溶液在8h内稳定。结果见表3。表3 稳定性试验结果编号 放置时间( h) 苦参碱峰面积 平均峰面积 RS

13、D(% )1 0 6230482 1 6212933 2 618762 621670 1.18074 4 6327035 8 612544 3.4 重复性试验取同一批供试品（批号：KC14003）5份，按“2.3”供试品溶液制备项下制备成供试品溶液。按上述色谱条件测定，结果如下：编号 苦参碱峰面积 苦参碱含量 平均含量 RSD(g·mL- 1 ) (g·mL- 1 ) (% )1 627463 55.4667 2 621254 54.9164 3 618960 54.7131 55.0435 0.51794 621752 54.96065 624011 55.1608RSD

14、为0.5179%，表明此法重复性良好。3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品6份，每份加入500ug/ml的对照品溶液1ml，按“2.3”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定，计算加样回收率，得平均回收率为100.6（n=6），RSD%为1.76，结果见表5。表5 加样回收率试验结果（n=6）编号 取样量 样品含量 对照品加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD(g) (mg) (mg) (mg) (%) (%) (%)1 0.5004 0.6855 0.6695 1.3712 102.4 2 0.5000 0.6850 0.6695 1.3690 102.23 0.4999 0

15、.6848 0.6695 1.3521 99.7 100.6 1.764 0.5004 0.6855 0.6695 1.3605 100.85 0.5007 0.6859 0.6695 1.3396 97.66 0.4998 0.6847 0.6695 1.3613 101.13.6 样品含量测定取3个批号苦黄颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，并计算苦参碱的含量，结果见表6。表6 样品测定结果（mg·mL-1）批号 各批苦参碱平均含量 （） 三批平均含量 RSD (% )KC14003 54.8832 LC14001 55.5627 54.9

16、413 1.08LC14002 54.37814. 讨 论4.1 色谱条件的选择色谱条件的选择包括色谱柱类型、流动相、检测波长等，其中，色谱柱、流动相的选择尤为重要。笔者参考中国药典（2010版）一部苦参项下苦参碱含量测定方法及相关文献8-9，考察了C18柱、氨基柱两种色谱柱及甲醇-水-3% 磷酸溶液、乙腈-水-3% 磷酸溶液乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液三种流动相系统，经梯度洗脱，分析比较得出氨基柱、流动相为乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液（32 : 5: 3）时测定苦参碱，分离效果较好，分析时间短，线性范围大。见表7。表7 色谱条件考察结果色谱柱 流动相系统 苦参碱测定结果 C18柱 甲醇-

17、水-3% 磷酸溶液 失败C18柱 乙腈-水-3% 磷酸溶液 失败氨基柱 乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液 成功 此外，用紫外分光扫描流动相的波长，发现在203 nm处有最大吸收，所以确定检测波长为203 nm。而35柱温、1.0ml·min- 1流速是参考文献资料而设定的。在上述色谱条件下，笔者曾比较过10L和5L的进样量对测定结果的影响，发现进样量为5L时，苦参碱出峰较好。4.2 供试品溶液制备方法的考察苦黄颗粒供试品的处理是关键，笔者参考2010版药典及相关文献中针对苦参碱测定的供试品制备方法10-11，考察了超声提取、加热回流提取、乙醚萃取三种提取制备方法，具体如下：超声提取。将

18、同批号的苦黄颗粒研磨成粉末，取粉末约1g, 精密称定，置100mL具塞锥形瓶中, 加氨试液1mL，润湿，加三氯甲烷50mL, 密塞, 称定重量。超声30min, 取出, 放冷, 再称定重量, 用三氯甲烷补足减失的重量, 摇匀,滤过，滤液蒸干，用流动相溶解残渣，转移至25 mL 容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 m）滤过, 续滤液作为供试品溶液。回流提取。将同批号的苦黄颗粒研磨成粉末，取粉末约1g, 精密称定，置100mL具塞锥形瓶中, 加氨试液1mL，润湿，加三氯甲烷50mL, 密塞, 称定重量。加热回流30min, 取出, 放冷, 再称定重量,摇匀,滤过，容器及滤纸用三氯

19、甲烷洗涤，滤液蒸干，用流动相溶解残渣，转移至25 mL 容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 m）滤过, 续滤液作为供试品溶液。乙醚萃取。将同批号的苦黄颗粒研磨成粉末，取粉末约1g, 精密称定，置100mL圆底烧瓶中，精密加入0.2%盐酸40 mL，称定重量，加热回流30min，取出，放冷，再称定重量，用0.2%盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，用浓氨试液调pH至7.8，用乙醚提取4次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，用流动相溶解残渣，转移至5 mL 容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 m）滤过, 续滤液作为供试品溶液。将上述三种方法

20、制备的供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，测定苦参碱含量，分析比较图谱，结果表明：超声提取时，苦参碱得率较低、杂质偏多；乙醚萃取时，杂质虽然较少，但苦参碱回收率极端低；加热回流提取时，苦参碱得率较高，杂质干扰较少。所以，本文实验选择加热回流提取的制备方法。4.3 苦参碱与氧化苦参碱有资料报道证明 12 , 苦参碱与氧化苦参碱两者之间存在着一种动态平衡的转化, 陆蕴如 陆蕴如，杨钟柯，董育妹.苦参在复方中化学成分变化的研究.中国中药杂志，1996，21（7）：412等研究了苦参在复方中化学成分的变化，结果表明，苦参与丹参、茵陈等配伍煎煮时，药液中检不到氧化苦参碱.本品复方含有苦参、茵陈。氧化苦参

21、碱可能已被转化。4.4 样品含量测定本次检测的3个批号苦黄颗粒样品中苦参碱含量稍高低不均，考虑可能与苦参药材的不同批次有关。由此可以看出，统一药材的来源、产地等相关因素，对控制制剂质量及其质量标准，保证其临床疗效，具有重要的意义。 目前，HPLC法广泛运用于中药复方中主要成分的测定14-15，具有选择性好、提取完全、精密度良好及回收率符合要求等优点，且整个实验过程可操作性强，能客观地控制本品的质量。故对其含量的测定多采用此法。苦黄颗粒为雷允上制药有限公司生产的中药复方制剂, 苦参为其主药，而苦参碱又为苦参的主要成分，具有清热利湿的功效，故常以苦参碱作为本品质量控制的定量指标。本试验结果表明，H

22、PLC法适用于苦黄颗粒中苦参碱的含量测定，并且优于现有方法，可以有效地提高药品质量及控制质量。9参考文献1 国家药典委员会.中国药典:一部S.北京:中国医药科技出版社,2010: 188.2苗抗立,张建中,董颖,等.苦参的化学成分及药理的研究进展J.天然产物研究与开发,2000,13 ( 2) : 69.3 季芳 ,阙瑞 艳 ,周小军 .高效液相色谱法测定苦黄颗粒中大黄素和大黄酚的含量J.陕西中医学院学报 , 2005,28 ( 6 ) : 491.4王以明, 张勇, 汪模辉, 等. 两相滴定法测定苦参碱片中苦参碱的含量 J.天然产物研究与开发, 2003, 15( 3) : 249- 250, 263.5伍庆. 高效薄层色谱测定中成