毕业论文逍遥散的抗抑郁研究

1、毕业论文逍遥散的抗抑郁研究逍遥散的抗抑郁研究摘要：探讨逍遥散的抗抑郁作用，为其疏肝解郁功效及临床应用提供 药理学参考。方法：采用小鼠的小鼠慢性温和不可预知应激(cums)结合孤 养抑郁模型的建立、小鼠体重测定、糖水消耗量实验、小鼠自主活动测 定、morris水迷宫等实验观察逍遥散的抗抑郁作用。关键词 抗抑郁抑郁症是一种常见的精神疾病，近年来其发病率呈不断上升趋势，己 成为全球性的主要精神卫生问题之一，与其相关的治疗药物日益受到重视。 逍遥散功用疏肝解郁、健脾养血，主治肝郁血虚脾弱z证，是调和肝脾的 代表方药。大量临床资料显示该方在精神科疾患治疗中运用广泛，特别是 在抑郁症的辅助治疗中取得较好疗

2、效。己有报道显示逍遥散可减少行为绝望模型小鼠的不动时间，提高cums模型大鼠的糖水消耗量等，表现出抗抑郁效应。为进一步验证其抗 抑郁作用，本课题通过利用一系列轻、中等强度的不可预知刺激结合孤养 方式对小鼠连续实施6周，造成cums结合孤养的小鼠抑郁模型，以小鼠 体重变化、行为学指标和糖水消耗实验来判定逍遥散的抗抑郁作用。糖水 消耗量反映动物的奖赏反应程度，模型动物出现糖水饮用量下降的现象， 称之为快感缺失，是抑郁症的核心症状。本次实验结果表明：小鼠被施加 慢性轻度不可预知应激结合孤养造模程序6周后，与空白组小鼠比较，其 体重增长缓慢，小鼠的糖水饮用量明显降低，阳性药阿米替林给予后可逆 转上述变

3、化。此外，实验中采用morris水迷宫对模型小鼠的空间学习记忆能力进行检测，发现模型 小鼠该能力明显下降。morris水迷宫检测的是动物的定向和搜索行为，能 反应动物对陌生环境的学习和记忆能力。因此，可以认为cums结合孤养 的造模方式不仅可干预小鼠的生长，降低小鼠的活动性、社会交往能力, 使模型小鼠出现抑郁症的核心症状快感缺失，而且还能模拟临床抑郁 症患者思维迟钝、学习记忆能力下降的表现，表明本次实验小鼠抑郁模型 复制成功。模型动物在给予逍遥散治疗后，逍遥散30、20g - kg-1剂量组 可不同程度逆转上述变化，表明逍遥散具有抗抑郁作用。同时，研究采用 小鼠自主活动实验，检测逍遥散在所试剂

4、量下有无中枢兴奋作用。实验结 果表明，逍遥散在所试剂量下对小鼠的自主活动无影响，表明其无中枢兴 奋作用，进一步明确了该方在所试剂量下的抗抑郁作用。综上，逍遥散不仅具有较好的抗抑郁作用，还可提高正常及抑郁模型 小鼠空间学习记忆能力，其作用可能与影响单胺类递质及抗氧化、改善脑 内血液循环冇关。1实验材料1.1实验药品逍遥散水煎液：组成按照方剂学所载：柴胡9g,当归宠白芍9g, 白术宠，茯苓宠，甘草4.5g,薄荷少许，生姜一块。药材均购自成都中陕 药大学附属医院老中医门诊部，经成都中医药大学中药标本屮心卢先明教授鉴定，柴胡为伞形科植物柴胡bupleurum chinense dc.的干燥根，当归为伞

5、形科植物当归angelica sinensis (oliv.) diels.的干燥根，白芍为毛良科植物芍药paeonia lactiflora pall.的干燥根，茯苓为多孔菌 科真菌茯苓poria cocos（schw.）wolf.的干燥菌核，口术为菊科植物口术 atractylodes macrocephala koidz.的干燥根茎，甘草为豆科植物甘草 glycyrrhiza uralensis fisch的干燥根及根茎，薄荷为唇形科植物薄荷 menthae haplocalyx briq.的干燥地上部分。制备方法：按比例取以上药材加 8倍量水浸泡30min,加热煮沸，文火煎煮lh,趁热

6、滤过；同法煎煮40min 及30min；合并三次滤液，文火浓缩至含生药lg ml-1和1.5g ml-1,药 液4°c冰箱保存备用。煎剂采用高效液相色谱法（中华人民共和国药典2005年版）对英中 的芍药昔进行定量分析，制备满足样品含量范围的标准曲线（见图2）,计算 样品中芍药昔的含量。结果表明：逍遥散1.5g-ml-l. lg - ml-1及0.5g ml-1水煎液中分别含芍药昔1.13mg mll、0.75mg ml-1 和 0.38mg ml-1,色谱图见图 2,3。figl.standard cuve of peordflorinfig2.hplc chromatography

7、 of peordflorinfig3. hplc chromatography of xiaoyao powder decoction阿米替林：sigma公司，批号039k1600，临用时用生理盐水配成所需 浓度溶液。1.2实验试剂芍药背对照品：中国药品生物制品检定所，批号：110736-201026o 0.9% 氯化钠注射液：四川科伦药业股份有限公司,批号b051030r苦味酸:台 山市众城化工有限公司，批号20090701雀巢奶粉：批号20100412a1.3实验动物及实验场地icr小鼠，雄性，初始体重25-28g,四川省医学科学院实验动物研究 所提供，合格证号:scxk (川)2008

8、-24o实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理科研三级实验室(no.tcm-03-043)o1.4实验仪器postar218高效液相色谱仪：美国瓦里安公司液相进样针(25 u i)：美国 hamilton companyvarian 325 uv/is检测器：美国瓦里安公司mt-200 morris水迷宫视频跟踪系统：成都泰盟科技有限公司ba-200小鼠避暗仪：成都泰盟科技有限公司zz6小鼠自主活动测定仪：成都泰盟科技有限公司101c-2型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司ld600-1型电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器冇限公司bs323s型电子天平：德国sartorious公司2

9、实验方法2.1逍遥散抗抑郁作用研究2.1.1逍遥散对慢性温和不可预知应激(cums)结合孤养抑郁模型动物 的影响2.1.1.1动物分组及给药方法选取健康雄性icr小鼠，初始体重25-28g,适应性饲养1周，5只/笼， 期间进行糖水训练及开场实验，于造模前id采用morris水迷宫对小鼠进 行学习记忆初筛（两轮共8次），以两轮在lmin内找到平台者为合格，否则 予以淘汰。以上指标结合体重，随机分为空白组，模型组，阿米替林组 （10mg - kg-1）逍遥散高、中、低剂量组（30、20、10g kg-1,分别为成人 （70kg）临床日用剂量的30、20、10倍）。除空白组5只/笼饲养外，其余各组均

10、单笼饲养并实施造模程序。造模2 周后开始给药，药物组灌胃给予相应药液，模型组和空白组灌胃给予等体 积蒸镭水，每天1次，连续4周。2.1.1.2实验方法2.1.1.2.1小鼠慢性温和不可预知应激（cums）结合孤养抑郁模型的建实验实施过程中，除空白组外，其余各组小鼠在6周内每天以23次的频率交替接受以下刺激：潮湿垫料（200ml水笼1）、异物刺激、置于空 笼、4°c冷刺激（冷水游泳）5min. 45°c热刺激5min（置于烘箱）、鼠笼450倾斜、1ma电刺激+周期性噪音（10db）、明暗颠倒、禁食、禁水等。所冇刺 激随机安排并尽量保证不在同一时间点进行，使小鼠不能预料刺激的发

11、生。具体执行安排见表lotabl. protocol of chr onic un predictable mild stress2.1.1.2.2小鼠体重测定分别在造模前id,造模2、4和6周进行小鼠体重测定，计算小鼠体重增长数（造模后体重造模前体重，g）o2.1.1.2.3糖水消耗量实验实验前，在环境安静的条件下训练小鼠使其适应含糖饮水，2d/次，训 练3次，然后在造模前id和造模后的每周星期一测定糖水饮用量：小鼠 禁食禁水18h后，每只小鼠给予2个已称重（初重，g）的喂水瓶（1瓶1%蔗 糖水,1瓶白水），lh后，取走水瓶并称量剩余液体重量（末重，g）,计算小 鼠的糖水消耗量（初重末重，g

12、）o2.1.1.2.4小鼠自主活动测定分别在造模前id和造模结束后id进行小鼠自主活动测定，在环境安 静的条件下将小鼠放入zz-6小鼠自主活动测定仪中，适应2min后观察 4min内的活动次数。2.2逍遥散对小鼠学习记忆能力的影响2.2.1实验方法2.2.1.1morris水迷宫实验方法morris水迷宫视频跟踪分析系统由水池、休息平台、记录装置和分析 软件组成。水池外有固定参照物如门、窗，挂件等。实验者每次试验位置 保持不变。水中加牛奶至不透明，水温为22-24°c,水面高于休息平台约 lcmo将水池平均分为四个象限（ne, nw, se, sw）,平台放于se象限中 央。检测时，

13、将小鼠头部及背部用苦味酸涂成黄色以做跟踪分析。morris水迷宫测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部 分：定位航行实验（place navigation）：每天每鼠训练4次。将小鼠分别从4 个象限面向池壁轻轻放入池中，测其60s内找到平台所需的时间（即逃避潜 期上scape latency, el）。如在60s内小鼠不能触到平台,则实验者将其引上 平台并令其停留15s,记录逃避潜伏期为60s,计算4次潜伏期的平均值作 为每天的成绩。以第3天训练的成绩作为小鼠的学习记忆成绩。空间探索试验(spacial probe test)：于第4天测定。撤除平台，从原平 台象限对侧池壁屮点将小鼠

14、放入水屮，记录60s内小鼠首次穿越原平台的 时间、穿越原平台的次数及原平台象限游泳时间占总时间的百分比，以反 映小鼠空间工作记忆能力。2.2.1.2逍遥散对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响采用morris水迷宫观察逍遥散对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的 影响。选取2.1.1项中小鼠于造模完毕后进行，方法同222。3结果与讨论3.1逍遥散抗抑郁作用研究3.1.1逍遥散对慢性温和不可预知应激(cums)结合孤养抑郁模型动 物的影响3.1.1.1逍遥散对抑郁模型小鼠体重的影响结果见表2及图4o结果表明：与空白组比较，模型小鼠体重增长数明显减少(p<0.05 或p<o.o

15、l),灌胃给药3周后，逍遥散各剂量组表现出一定提高模型小鼠 体重增长的趋势；在给药4周后，逍遥散高剂量组(30g - kg-1)小鼠体重增 长己明显高于模型组(p<0.05),中、低剂量(20、10gkgl)均表现出一定 提高趋势。阿米替林 kgl)对模型小鼠体重增长无明显作用。tab2. effect of xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice 仕s)mice(ndose(g-kweight increasing (g)groupcontrol 10g-1)-1.72* 4.08model101.49ami

16、triptyline 100.013.99±4.67±2.35 ±4.56±2.133.13 6.92士1.95*2.25* 6.46士week 2 5.64week 4 ±&71week 6 ±11.382.02xiaoyao10powder xiaoyao10powder xiaoyao10powder102.15201.64 4.02士5.43±2.02301.98 4.11士5.06±1.274.04士5.26±2.352.348.002.52* 7.182.24 7.361.86+ohm

17、bnotes: compared with model group: *p<0.05, *p<0.01fig4 effect of xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice3.1.1.2逍遥散对抑郁模型小鼠糖水消耗量的影响结果见表3和图5o结果表明：与空白组比较，模型小鼠从造模第2周起，其糖水消耗量 便持续减少(p<o.o5或p<o.ol),提示造模程序能引起小鼠的快感缺 失。灌胃给药3周后，阿米替林(10mg kgl)及逍遥散高剂量(30g kg-1) 明显提高模型组小

18、鼠糖水消耗量(p<o.o5),逍遥散中剂量(20g - kg-1)现 出了一定提高趋势。给药4周后，除阿米替林，逍遥散高剂量组外，逍遥 散屮剂量(20g - kg-1)也使模型小鼠糖水消耗量明显升高(p<0.05),低剂 量(10g kgl)仅有提高的趋势。tab3 effect of xiaoyao powder on sweet water con sumption in cums model mice (±s)dosemicegroup(n)kg-1)2.45control 10 - ±0.76 2.39model 10 - ±0

19、.78amitripty10line 0.01 ±±0.58 0.94 0.86 0.80* 1.21*2.352.052.23±2.10±2.33±2.46±2.03±±0.62* 0.611.631.26±1.21±1.51±1.48±1.09±±0.92 0.521.751.22±1.43±1.83±2.09±1.97±0.81 0.55 0.49 0.57 0.91* 0.56* 0.62*0.43

20、* (g-line 12 3 base week week week week 4 week 5 week 60.222.41xys 10 30 ±1.062.37xys 10 20 ±0.912.43xys 10 10 ±0.61 0.65 1.781.26±1.48±1.76±2.07±1.74±±0.94 0.511.601.27±1.49±1.61±1.70±1.71±±0.90 0.75 1.731.24±1.13±

21、1.40±1.36±1.39±±0.74 0.72 0.36 0.74 0.80 0.54 1.16 0.52 0.74 0.60* 0.42 0.64 0.54* 0.62*notes: compared with model group: *p<0.05, *p<0.01.xys means xiaoyao powder.fig5. effect of xiaoyao powder on sweet water con sumption in cums model mice3.1.1.3逍遥散对抑郁模型小鼠自主活动的影响结

22、果见表4结果表明：与空白组比较造模前后小鼠自主活动无显著性差异，表明 逍遥散在所试剂量下对cums小鼠自主活动无明显影响。tab4. effect of xiaoyao powder on locomotor activity in cums mice (±s)dose number of moving numbermice(groupn)kg-1) base line week 6control 10 101.30±92.5base line week 6 ±54.50±57.80±(g-/4min rearing/4min of16.90m

23、odelamitripty linexys 10 30 25.74xys 10 2023.69xys 10 1029.61 0.01 18.63 10 26.33 17.77 14.17 1.77106.60±104.80±55.20±62.6±9.66 15.60 18.02 90.40±94.811.02±57.40±5983±205 9.43 102.10±96.40±52.60±56.80±3.02 10.00 8.11 95.10±97.00±5

24、9.50±56.67±5.72 21.10 3.21 96.00±88.25±54.60±57.50±8.63 12.90 4.53综上，逍遥散可缓解cums小鼠的体重增长缓慢，提高其运动能力及 探索能力，并能拮抗cums小鼠的快感缺失，表现出良好的抗抑郁作用。 同时，在英有效剂量下，不会影响小鼠自主活动。3.2逍遥散对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响结果见表5及图6o结果表叽与空白组比较,模型小鼠逃避潜伏期明显延长(p<005), 同时空间探索实验中穿越平台的次数及原平台象限游泳时间占总时间的 百分比显著减少(p<0.01),提示造模程序能使小鼠空间学习记忆能力降 低。给药4周后，逍遥散高剂量(30g - kg-1)使模型小鼠的逃避潜伏期明显 缩短(p<005),穿越原平台的次数明显