纸层析法分离氨基酸实用教案

1、会计学1纸层析纸层析(cn x)法分离氨基酸法分离氨基酸第一页，共28页。第1页/共28页第二页，共28页。第2页/共28页第三页，共28页。第3页/共28页第四页，共28页。二、纸层析(cn x) ( (一一) ) 原理原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂固定相，而以有机溶剂( (与水不相混溶或部分混与水不相混溶或部分混溶溶) )作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数。由于各物质有不同的

2、分配系数(xsh)(xsh)，移动，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。速度因此不同，从而达到分离的目的。 第4页/共28页第五页，共28页。第5页/共28页第六页，共28页。溶质在滤纸上移动的速率可用溶质在滤纸上移动的速率可用RfRf值表示值表示： Rf= X/ Y Rf= X/ Y式中式中X X：溶质斑点中心的移动距离：溶质斑点中心的移动距离 Y Y：溶剂前沿移动的距离：溶剂前沿移动的距离 Rf Rf值决定值决定(judng)(judng)于分配系数。于分配系数。 不同物质的分配系数不同物质的分配系数(xsh)不同，不同，Rf值也不相同，由值也不相同，由此可以根据此可以根据Rf值的大小对

3、物质进行定性分析。值的大小对物质进行定性分析。 第6页/共28页第七页，共28页。(二二) 影响影响(yngxing)Rf值的主要因素值的主要因素 1.1.物质的结构和极性物质的结构和极性 2.2. 物质的结构和分子极性是影响物质的结构和分子极性是影响RfRf值的主要因素值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其RfRf值就值就较小，反之亦然。较小，反之亦然。 2. 2.滤纸滤纸 3.3. 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所因此结合的水量不一样，两相的体

4、积比也就不同。所以同一种物质在不同型号以同一种物质在不同型号(xngho)(xngho)的滤纸上进行层的滤纸上进行层析时，所得到的析时，所得到的RfRf值也不相同。值也不相同。 4.4. 此外，滤纸上所含的杂质也会影响此外，滤纸上所含的杂质也会影响RfRf值。值。5.5. 第7页/共28页第八页，共28页。3.3.层析所用的溶剂层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行同一物质在不同的溶剂系统中进行(jnxng)(jnxng)层析时，层析时，RfRf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使RfRf值的值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的

5、重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的RfRf值应在值应在0.05-0.05-0.850.85之间，样品中被分离组分的之间，样品中被分离组分的RfRf之差最好大于之差最好大于0.050.05。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等第8页/共28页第九页，共28页。4.pH4.pH值值 溶剂和样品的溶剂和样品的pHpH值会影响物质的解离，从而影响物值会影响物质的解

6、离，从而影响物质的极性和溶解度，使质的极性和溶解度，使RfRf值改变。溶剂的酸碱度增大则值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的流动相的含水量增高，使极性物质的RfRf值增加；反之则值增加；反之则降低降低(jingd)(jingd)。 为了避免或减少为了避免或减少pHpH值对值对RfRf值的影响，可将滤纸和溶值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pHpH值。值。 5.5.温度温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积数；也影响滤纸

7、纤维的水合作用，即影响固定相的体积. .所以温度的改变使所以温度的改变使RfRf值变化很大，为此，层析必须在恒值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。温条件下进行。 第9页/共28页第十页，共28页。6.6.展开方式展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf Rf 值不相值不相同。用下行法展开时，同。用下行法展开时，RfRf值较大；用上行法展开时，值较大；用上行法展开时，RfRf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限

8、制限制(xinzh)(xinzh)了溶剂的流动，了溶剂的流动，RfRf值也较小。值也较小。 7.7.样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对样品溶液中存在杂质时，有时对RfRf值有所影响值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf Rf 值。值。 第10页/共28页第十一页，共28页。(三三) 操作方法操作方法 1.1.样品处理样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的的pHpH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。

9、需稀释。 2.2.点样点样 将滤纸将滤纸(lzh)(lzh)裁成适当大小，用铅笔在距边线裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm2cm左左右划一直线右划一直线( (称为原线称为原线) )，线上每隔，线上每隔2-3cm2-3cm划一圆点划一圆点( (称为原称为原点点) )。然后用点样器。然后用点样器( (定性分析可用普通毛细管，定量分析定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器需用微量注射器) )轻轻点在原点上。样品点的直径约轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.3-0.5cm0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量

10、为一般每一样品的量为5-30g5-30g。点样一般采用少量多次，每。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。 第11页/共28页第十二页，共28页。第12页/共28页第十三页，共28页。3.3.平衡平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平平衡衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂

11、蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变(gibin)(gibin)溶剂系统的组成溶剂系统的组成, ,严重影响层析效果。平衡一般在严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。密闭的层析缸内进行。 第13页/共28页第十四页，共28页。4.4.展开展开 平衡结束平衡结束(jish)(jish)后，将滤纸靠样品点的一后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm1cm，此，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端时即开始展开。当溶

12、剂前沿到达滤纸另一端0.5-0.5-1cm1cm处时，展开结束处时，展开结束(jish)(jish)，取出滤纸，在溶，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。行、下行和环行三种方式。 (1) (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间

13、较长。法，但展开时间较长。 (2) (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但，但RfRf值的重现性较差，斑点易扩散。值的重现性较差，斑点易扩散。 第14页/共28页第十五页，共28页。 (3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向(fngxing)流动。由于溶剂向圆周方向(fngxing)扩散，所

14、以展开的图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向(fngxing)性的特制滤纸。 （4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。 第15页/共28页第十六页，共28页。5.5.显色显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) (1) 显色剂显示：显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色被分离物质与显色剂生成

15、有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍、浸渍(jnz)(jnz)法法或涂刷法。或涂刷法。 (2) (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素生素B1B1、B2B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。的斑点。 6.6.定性分析定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的RfRf值，值，就可以对物质进行定性。就可以

16、对物质进行定性。 第16页/共28页第十七页，共28页。7.7.定量定量(dngling)(dngling)分析分析 对被分离的物质进行定量对被分离的物质进行定量(dngling)(dngling)的方法很多，的方法很多，常用的有：常用的有： (1) (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量后，通过分光光度计进行比色定量(dngling)(dngling)。 (2) (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。求出待测物的含量。 (3) (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积面积与物质含量