MAPK信号通路presentation

1、王德美2014.12.17淀粉样前体蛋白淀粉样前体蛋白(APP)(APP)的突变在的突变在淀粉样多肽（淀粉样多肽（A）形成过程中作形成过程中作用研究用研究内容概要研究背景研究思路及核心技术创新点展望内容概要研究背景研究背景研究思路及核心技术创新点41.1 1.1 阿尔茨海默症阿尔茨海默症（Alzheimers disease, AD）1906年报道1例51岁女性患者，进行性记忆和语言能力丧失及识别能力障碍，病情逐渐恶化、4年半后死亡，病解发现脑萎缩、老年斑和神经原纤维改变。65-69 70-74 75-79 80-84 85-89 90-94 95-99年龄年龄 (年年)5病理特征：淀粉样蛋白

2、沉积淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结。老年斑神经元纤维缠结61.2 1.2 淀粉样蛋白级联假说淀粉样蛋白级联假说Amyloid cascade hypothesisneurodegenerationFomation of brain oligomeric A or deposition of fibrillar A accumulationAmyoid precursor protein(APP)Pathogenesis：increased，altered production or reduced clearance of Ahere

3、ditary factorenvironmental factor- secretase- secretaseA（observed in the brain of patients with ADAD and SAD）APP 淀粉样前体蛋白A 淀粉样多肽- secretase 分泌酶- secretase 分泌酶APPC83APP水解途径水解途径非淀粉样途径：被-分泌酶（C83）和-分泌酶连续切割淀粉样途径 ：A的产生，被-分泌酶（C99）（670Met671Asp之间）和分泌酶依次切割APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。8APP水解途径水解途径分泌酶水解67

4、0Met671Asp之间的肽键，将APP一分为二，生成670个氨基酸的APP片段和带完整A的跨膜C段。l非淀粉样途径：被-分泌酶（C83）和-分泌酶连续切割l淀粉样途径 ：A的产生，被-分泌酶（C99）和分泌酶依次切割课题选取的5个APP突变突变位点突变位点氨基酸残基替换氨基酸残基替换突变命名突变命名发现时间发现时间673AT冰岛人突变2012年NatureAV2009年Science682EK2011年693EG北极人突变2001年Nature NeuroscienceEQ荷兰人突变1990年Science选取理由：2个早期发现突变E693G和E693Q，剩余3个为近些年发现的突变。对比研究

5、。app基因基因碱基序列碱基序列突变位点突变位点碱基替碱基替换换APP蛋白氨蛋白氨基酸序列突基酸序列突变位点变位点密码子改变密码子改变氨基酸替氨基酸替换换密码子名称密码子名称2217GA673GCAACAAT丙氨酸苏氨酸2218CT673GCAGUAAV丙氨酸缬氨酸2244GA682GAAAAAEK谷氨酸赖氨酸2278AG693GAAGGAEG谷氨酸甘氨酸2277GC693GAACAAEQ谷氨酸谷氨酰胺内容概要研究背景研究思路及核心技术研究思路及核心技术创新点展望 表征： APP level C99 level A level本课题选取5个APP突变，研究不同APP突变对A形成过程的不同作用2

6、.1 研究出发点 2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测 建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2 设计思路及核心技术2.2.1 构建构建BACE1 稳转稳转 HEK293 细胞株细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测 建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2 设计思路及核心技术 2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株2.2.2 突变突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测 建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2

7、.2 设计思路及核心技术APP基因序列重叠延伸法PCR引入突变位点pcDNA4A+BC+D 采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。重叠延伸PCR在基因的定点突变中具有重要应用。引物设计两端引物两端引物APP(F)AAACAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTGAPP(R)CCCCGCTAGTCTAGAGTTCTGCATCTGCTCAA突变点引物APPA673T(F)GAAGTGAAGATGGATACAGAATTCCGACATGACAPPA673T(R)GTCATGTCGGAATTCTGTA

8、TCCATCTTCACTTCAPPA673V(F)gaagtgaagatggatgtagaattccgacatgac APPA673V(R)gtcatgtcggaattctacatccatcttcacttcAPPE682K(F)ccgacatgactcaggatacaaagttcatcatcaa APPE682K(R)ttgatgatgaactttgtatcctgagtcatgtcggAPPE693G(F)ggtgttctttgcaggagatgtgggttcaaacAPPE693G(R)gtttgaacccacatctcctgcaaagaacaccAPPE693Q(F)ggtgttctttg

9、cacaagatgtgggttcaaacAPPE693Q(R)gtttgaacccacatcttgtgcaaagaacacc20重叠延伸法重叠延伸法PCR结果结果突变及检验突变及检验MarkerDNA Ladder2.3kb 双酶切结果双酶切结果5.0kb2.1kb A673T A673V E682K E693G E693QAPP WTA673TA673VE682KE693GE693QpcDNA4双酶切验证结果双酶切验证结果成功构建5个APP突变基因真核表达载体。野生APP基因约为2.3kb，pcDNA4为5.1kb，选用内切酶为Hind和Xba，下图为琼脂糖凝胶电泳结果（酶切后两片段约为2.

10、1kb和5.0kb）：重组检验自左向右：1为Maker；2、3为APPA673T；4、5为APPA673V;6、7为APPE682K;8、9为APPE693G;10、11为APPE693Q。其中，2、3、4、6、7、8、9、10、11为阳性结果。说明成功构建APP突变基因真核表达系统。 2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构2.2.3 转染转染 2.2.4 检测 建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2 设计思路及核心技术脂质体介导瞬时转染 2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染2.2.4 检测检测 建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2 设计思路及核心技术检测APP、C99和AWestern Blot 、 ELlSA 、质谱APPC83APP水解途径水解途径非淀粉样途径：被-分泌酶（C83）和-分泌酶连续切割淀粉样途径 ：A的产生，被-分泌