液体流经色谱柱时实用教案

1、会计学1液体液体(yt)流经色谱柱时流经色谱柱时第一页，共42页。2 液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用(ciyng)了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。第1页/共42页第二页，共42页。3慢中等快Temporal course淋洗液第2页/共42页第三页，共42页。4 叶绿素的柱色谱(s p)第3页/共42页第四页，共42页。5三组分(zfn)混合物的分离第4页/共42页第五页，共42页。6在C18柱中，三组分(zfn)混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。 当试样混合

2、物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关： K = 化合物在固定相中的浓度C固 化合物在流动相中的浓度C流 K值小，先流出柱子，K值大的，保留(boli)作用强，后流出柱子。第5页/共42页第六页，共42页。7第6页/共42页第七页，共42页。8 键合相-反相色谱第7页/共42页第八页，共42页。91. 概 述色谱法：(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用

3、的差异(chy)为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面(biomin)的冲洗剂。第8页/共42页第九页，共42页。101-4 高效(o xio)液相色谱法的特点一 高压 液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过(tnggu)色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到150300kgcm2，甚至可达700kcm2以上。第9页/共42页第十页，共42页。11二 高速 高效液相色谱(s p)所需的分

4、析时间较之经典液体色谱(s p)快得多，一般可达l10mLmin， 个别可高达100mLmin以上，这已近似于气相色谱(s p)的流速。 三 高效 气相色谱的分离(fnl)效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理论塔板米；第10页/共42页第十一页，共42页。12四 高灵敏度 紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行(jnxng)全分析。 第11页/共42页第十二页，共42页。131-5 高效(o xio)液相色谱流程和设备 高效液相色谱仪一般可分为5个

5、主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过(jnggu)进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 第12页/共42页第十三页，共42页。14第13页/共42页第十四页，共42页。15样品吸收(xshu)度测定吸收(xshu)池示图第14页/共42页第十五页，共42页。16紫外检测器工作(gngzu)原理第15页/共42页第

6、十六页，共42页。17第16页/共42页第十七页，共42页。18 废液样品 淋洗液 至分离柱进样阀 样品(yngpn) 废液 淋洗液至分离(fnl)柱 定量(dngling)环进样（）（） 样品环第17页/共42页第十八页，共42页。19液相色谱(s p)动画演示第18页/共42页第十九页，共42页。20二、色谱(s p)图（chromatogram） 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变(zhunbin)为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号时间曲线或信号流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图12-2常用(chn yn)术语：1.

7、 基线 : 在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。第19页/共42页第二十页，共42页。212. 色谱峰: 当组分随流动相进入(jnr)检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。第20页/共42页第二十一页，共42页。2221 保 留 值 一、保留时间（tR） 从进样开始到柱后出现样品(yngpn)的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。第21页/共42页第二十二页，共42页。232-2 色谱(s p)柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论(lln) 塔板理论认为，一根柱子(zh zi)可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一

8、段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/n式中n为理论塔板数。第22页/共42页第二十三页，共42页。24 色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量(dngling)地用理论塔板数N来表示。 理论(lln)塔板数一N还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的V值。第23页/共42页第二十四页，共42页。25 可用半峰高处的峰宽(半峰宽）和保留时间的关系(gun x)来表示理论塔板数N，这时关系(gun x)式为： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2式中： Wt1/2 -半峰宽例如(lr)，从图2-3，测得tR=105mm、 Wt1/

9、2 =4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200. 第24页/共42页第二十五页，共42页。262-3 分离度及影响(yngxing)因素一 分离度（分辨率) 研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定(qudng)相邻两峰的分离程度。 从图8-3可以看出，为了(wi le)获得较好的分离，就必须使最大峰值之间的距离增加，峰宽减小。第25页/共42页第二十六页，共42页。27第26页/共42页第二十七页，共42页。28 一般用Rs来定量表达(biod)相邻两峰的分离程度，所以Rs是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。要求RS1.5 tR1 tR2 R

10、s = 1/2(W1+W2) 式中 tR1、tR2 分别为两组分(zfn)的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度 . 第27页/共42页第二十八页，共42页。295 高效液相色谱的定性(dng xng)和定量分析 5-1 定性分析(dngxngfnx) 在液相色谱(s p)中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R或V R ）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱(s p)柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。 第28页/共42页第二

11、十九页，共42页。305-2 定量分析(dnglingfnx) HPLC色谱定量的基本(jbn)方法有内标法、外标法等。 外标法标准曲线法 是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则(fz)是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。第29页/共42页第三十页，共42页。31具体作法是： 用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确(zhnqu)量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。第30页

12、/共42页第三十一页，共42页。32 目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域(ln y)和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。 例如：蛋白质、核酸(h sun)、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防老剂等等。 第31页/共42页第三十二页，共42页。33 高效液相色谱，特别适用于分离沸点高和热稳定性差的物质，目前已广泛(gungfn)用于化工、食品、医药、生化、卫生、环境保护和高能化合物等生产和科研工作中。 第32页/共42页第三十三页，共42页。34第33页/共42页第三十四页，共42页。35第34页