橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析

1、橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析橡胶树白粉菌 (Oidium heveae B A. Steinmann) 是橡胶树白粉病的病原菌 , 具有专性寄生的特性 , 对天然橡胶的产量有极大的影响。橡胶白粉菌的相关研究 主要集中在病原菌和寄主细胞学观察、病害预测防治方面 , 而关于分子方面的研 究, 致病性相关基因及其功能鲜有报道。为验证橡胶树白粉菌致病过程中基因的表达差异和调控机制 , 本实验在橡胶 树白粉菌HO-73菌株基因组和与橡胶品系7-33-97互作转录组的基础上,筛选到 致病和MAPKt号途径相关基因，监测其在橡胶树白粉菌致病过程中的表达差异， 为进一步验证其

2、具体功能提供理论基础。主要研究结果如下： 1用HO-73菌株 接种寄主培养 12d 新鲜孢子接种在抽芽 7-10d 叶龄橡胶叶片上 , 分别培养至 1d、 3d、 30d, 提取 RNA。在橡胶白粉菌基因组测序(未发表)基础上,通过GO4释,选取其中11个和致 病性相关的基因(GO 0009405),进行克隆、qRT-PCF扩增，分析其在致病过程中 的表达差异 , 并与转录组相对应。结果表明：在 1dpi (day past infection),初次侵染器官附着胞、吸器等发育完成 ,Oh-Imp 、 Oh-hypothetical protein-4 为 上调基因 , 其可能与侵染初期侵染器

3、官的生长相关； 3dpi 菌丝体生长时期 , 代谢 基因 Oh-PC2 Oh-Gprotein beta subunit/AC1、Oh-EKA生长基因 Oh-AAA)eroxin, Oh-RNP和 Oh-Imp;假定蛋白 Oh-hypothetical protein-1,2,3, 为上调基因，这些 基因可能与菌丝生长密切相关； 30dpi 产生新生分生孢子阶段 ,代谢基因 Oh-PC2, 生长基因Oh-RNP假定蛋白Oh-hypothetical protein-1,2,3为上调基因，这些 基因可能与分生孢子产生有关。2、利用橡胶白粉菌基因组数据库和小麦白粉菌 (Blumeria grami

4、nis) 的同源 序列进行比对,获得25个MAPKS号途径相关基因。并运用蛋白质结构域及聚类 分析,构建橡胶树白粉菌中的MAPI级联途径简图，共发现了 1个MAPI基因、1个 MAPK基因和3个MAPKK基因,为继续探究植物病原真菌 MAP信号途径基因的 功能奠定了基础。橡胶白粉菌在 parafilm 表面培养 0-24hpi(hours post inoculation) 的侵 染发育可大致归纳为未萌发 (0hpi) 、萌发 (4hpi) 、附着胞形成 (6 、 8hpi) 和次生 附着胞(16、24hpi)等4个形态发育阶段；在此基础上检测MAPK!号途径相关的 基因在 parafilm

5、表面的表达差异情况。在 4hpi 芽管生成时,全部基因为上调 , 上调倍数较大的基因有 20892、18727、8311和4961,证明MAPI途径的Fus3and Ksslpathway在芽管生成时发挥主要作用；8hpi附着胞形成时，全部基因也都为 上调基因 , 上调倍数明显增大的为基因 1505、 4241、 4865、 5368、 18727、 20892, 证明MAPK号途径中的MEK1 Bkk1、Bck1和Wis4在附看胞形成过程中起主要 作用； 16hpi 吸器形成时,4961 为下调基因 ,剩余为上调基因 ,明显上调的基因为 1505、4241、9052、20892,证明在吸器形

6、成时,MAPK途径中的 Hog1MAPKathway 起主要作用； 24hpi 菌丝生成时 ,全部基因为上调 ,明显上调的基因为 4241、4961、 8311、18727、9052和20892,证明在此阶段起主要作用的为 MAPI途径中的 Hog1pathway。用MAP信号途径特异性外源抑制剂一一U0126处理,促使白粉菌在非诱导琼 脂表面萌发并形成附着胞。在1.0%琼脂培养介质中加入浓度为10卩mol/L-30卩 mol/L 浓度梯度的 U0126。结果表明，随抑制剂U0126的浓度增加，抱子萌发率明显下降，且与未加入抑制剂的对照有显著差异(P<0.05)。24hpi时,10卩mol/L最终萌发率为57%