生物转化与甾体药物

1、陈代杰陈代杰上海来益生物药物研究开发中心上海来益生物药物研究开发中心Shanghai Health-Creation Centre for Biopharmaceuticals R & D1）应用基因工程技术来构建具有高度专一性和高）应用基因工程技术来构建具有高度专一性和高转化率的基因工程菌；转化率的基因工程菌；2）增加底物在水相中的溶解性；）增加底物在水相中的溶解性；3）改良固定化酶或固定化细胞的技术；）改良固定化酶或固定化细胞的技术；4）开发连续转化和产物回收的技术；）开发连续转化和产物回收的技术；5）在培养基中应用像环糊精类物质来提高底物转）在培养基中应用像环糊精类物质来提高底物

2、转化率。化率。 尽管有不少用于不饱和甾体边链尽管有不少用于不饱和甾体边链氧化的有效的化学方法，但对饱和氧化的有效的化学方法，但对饱和的脂肪族的脂肪族C-17边链的氧化反应的收边链的氧化反应的收率非常低，而用微生物转化技术除率非常低，而用微生物转化技术除去植物甾醇的边链是一种非常有效去植物甾醇的边链是一种非常有效的方法。的方法。http:/ 尽管在甾体的分子结构中有许多尽管在甾体的分子结构中有许多可以被微生物进行羟基化的基团，可以被微生物进行羟基化的基团，但目前在工业规模大量用微生物转但目前在工业规模大量用微生物转化技术进行的羟基化反应主要是化技术进行的羟基化反应主要是11 -、11 -和和16

3、 -位点的羟基化反位点的羟基化反应。其它一些可以在工业规模用微应。其它一些可以在工业规模用微生物转化技术进行羟基化反应的位生物转化技术进行羟基化反应的位点包括有点包括有7 -、9 -和和14 -。 COOHHOHOHHOOOCH3OCH3HOOCH3OCH3HOOCH3HNCH3HOHOC2H5HOC2H5HODeoxycholic acid (I)Hecogenin (II)Diosgenin (III)Solasodine (IV)Ergosterol (V)Stigm asterol (VI)Sitosterol (VII)Cholesterol (VIII) I：脱氧胆酸； II：海柯

4、皂配基； III：薯蓣皂苷配基； IV：茄解定； V：麦角甾醇; VI：豆油甾醇； VII：谷甾醇； VIII：胆甾醇； 9111213148171615105671234HO19182023222625242127HOHOHO2425262728282922232829CholesterolCampesterolSitosterolStigmasteroll氧氧 化化 反反 应应 （）羟基化（）羟基化 所有甾体母核和角甲基位置均几被羟化所有甾体母核和角甲基位置均几被羟化 能在边链上若干位置上羟基化能在边链上若干位置上羟基化（）醇基氧化（）醇基氧化 氧化饱和链上醇基至酮基氧化饱和链上醇基至酮基

5、氧化丙烯基或高丙烯基至氧化丙烯基或高丙烯基至、-不饱和酮不饱和酮（）环氧化作用（）环氧化作用（ Epoxidation ）（）（）碳碳键的裂开碳碳键的裂开 氧的插入（氧的插入（Insertion）形成酯、醇、酮、内酯和酸形成酯、醇、酮、内酯和酸 逆醛醇缩合反应（逆醛醇缩合反应（ Retroaldol reactions） 碳键裂开产生非官能团化的产物（碳键裂开产生非官能团化的产物（Unfunctionalized products）（）（）双键的导入反应双键的导入反应 饱和饱和3酮和酮和4-3酮甾体的酮甾体的1位脱氢位脱氢 饱和饱和3酮和酮和-3酮甾体的酮甾体的4位脱氢位脱氢 伴着环芳香化的位

6、脱氢伴着环芳香化的位脱氢 1（10）53甾醇的芳香甾醇的芳香 化化 羟基、酯或过氧化合的消除羟基、酯或过氧化合的消除（）过氧化反应（）过氧化反应 5，7-双烯间形成双烯间形成5、8-表二氢化合物表二氢化合物 氢过氧化（氢过氧化（Hydroperoxidation）杂原子氧化杂原子氧化 立体专一性氧化硫醚到亚砜立体专一性氧化硫醚到亚砜 胺胺 被被 氧氧 化化 到到 酮酮 还还 原原 反反 应应（）（） 还还 原原 酮酮 到到 醇醇 （）（） 还还 原原 醛醛 到到 醇醇 （）（） 还还 原某氢过氧化物到醇原某氢过氧化物到醇（）（） 还还 原原 烯烯 醇醇 到到 伯伯 醇醇（）（） 双双 键键 饱

7、饱 和和 还还 原原1，4-3-酮到酮到4-3-酮酮 还还 原原4-3-酮到饱和酮到饱和- 酮酮 还还 原原4，6-3-酮到酮到4-3-酮酮 还还 原原1，6-20-酮到饱和酮到饱和20-酮酮 厌厌 氧氧 性性 脱脱 羟羟 基基 l异异 构构 化化 （）（）6-3-酮异构化成酮异构化成4-3-酮酮 （）（）-高环化（高环化（D-Homoannulation）（）（）反频哪酮重排（反频哪酮重排（Retropinacolic rearrangement） （）（）醇差向（立体）异构醇差向（立体）异构（）（）-表二氢化合物重排到桥氧醇表二氢化合物重排到桥氧醇 l结结 合合 （ 1 ） 羟羟 基基 乙

8、乙 酰化酰化 （）（） 糖苷化糖苷化 （）（） 酚酚 醚醚 形形 成成 （）（） 胺胺 的的 乙酰乙酰 化化 （）甾体生物碱与碳酸相结合（）甾体生物碱与碳酸相结合l水水 解解（1 ）酯化）酯化 碳碳 酸酸 酯酯 内内 酯酯 硫硫 酸酸 酯酯 （ ） 醚醚 开开 裂裂 烯烯 醇醇 醚醚 开开 裂裂 为为 酮酮 酚酚 醚醚 开开 裂裂 为为 酚酚 苷苷 开开 裂裂 为为 醇醇 l引入引入 杂杂 原原 子子 ： （1）氮）氮 ：由：由21位醇基甾体形成位醇基甾体形成21-乙酰胺甾体乙酰胺甾体 （）卤（）卤 素素 ：卤过氢化酶催化导入：卤过氢化酶催化导入CH2OHCOOHHOOOCOOHOCH2OHO

9、COOHOCOOHOOO-C2H5COOH-CH3COOH-C2H5COOHOOCOOHOCOOHOOOCholesterol(V III)(XIII)(IX)(XIV)(XVIII)(XIX)(X X )(XV)(XVI)(XVII)(XXI)(XXII)(XXIII)ADD4ADXV：甾醇甾醇C24-羧酸；羧酸； XVI：甾醇甾醇C22-羧酸；羧酸； XVII：雄甾雄甾-4-烯烯-3,17-二酮二酮(AD)；XVIII：C19-甾醇；甾醇；XXIII：雄甾雄甾-1,4-双烯双烯-3,17-二酮二酮(ADD)；其余参见文章内其余参见文章内 HOCH2ROCH2ROCH2CH2OHROCH2C

10、OSCoAROCHCSCoAROROCH2OROCOSCoARHOHOHOOCOOCOOOCOOHR CH3=Sitosterol(VII)H=Canpesteriol(XXV)HO(XXVI)(XXVII)(XXVIII)(XXXI)(XXXII)(XXX)(XV)(XIV)(XVII)(XXIX)-C2H5COSCoA-CO2OCO CoEnz-R-CH2COOH-CH3COOH-C2H5COOH图 、微生物裂解甾醇和采油甾醇边链的反应OH OC O O HOOC H2O HOO C H3OOOOOOOOOOOOOOO HO( X V I I )( L V I I )( V I I )H

11、O O COOOOOH OOO HO HOO HOH OH O( L V I I I )O H( X X I I I )( X V I I )( L X I I )( L X I )( L I X )( L X )( X V I I )( X X I I I )H OC O2H2OWi l d t y p eA T O C6 8 4 2S C M- 1N R R LB - 8 1 1 9N R R LB - 1 1 0 4 5N R R LB - 8 1 2 9N R R LB - 8 1 2 8N R R LB - 8 1 1 3 5 9B - 8 1 3 5l1)添加有关的酶抑制剂添加有关

12、的酶抑制剂l2)利用被修饰的底物进行生物转化利用被修饰的底物进行生物转化l3)利用阻断突变株用于定向生物转化利用阻断突变株用于定向生物转化同时利用突变同时利用突变株、酶抑制剂株、酶抑制剂和被修饰的底和被修饰的底物进行生物降物进行生物降解边链所得到解边链所得到的产物的产物A c OC H2O HC2H5H OOS ito stero l d eriv a tiv e(L X III)E stero n e(X X X V II)H OOOH OROOOOH OC h o le ste ro l(V III)A n d ro sta -1 ,4 -d ie n e-3 ,1 7 -d io n e

13、 (X X III)R = H -c h o leste ro l(V III) C 2 H 5 -sito ste ro l(V II)A n d ro st-4 -e n e-3 ,1 7 -d io n e (V V II)-h y d ro x y a n d ro st-4 -en e -3 ,1 7 -d io n eM y c o b ac te riaN o ca rd ia S p .w ild ty p een z y m e in h ib ito rsM y co b a c te riu m S p .m u tan tsm u ta n tsm u ta n tsO

14、OA n d ro sta-1 ,4 -d ien e -3 ,1 7 -d io n e(X X III)M y co b a c te riu m S p .M y c o b ac te riu m S p .部分边链降解的甾醇产物COOHOCOOHOOOOO图 同时利用突变株、酶抑制剂和被修饰的底物进行生物降解边链所得到的产物OOCH3HOOHOHOOCH3OCOOCH3CH2OHCH2OHCH2OH(LX)(LXIV)(LIX)(LXV)(LXIV)(LXI)(LXVI)(LXVII)图 部分边链降解的甾醇产物OOOHOOHHOOH(CH3)2NO米 非 司 酮OOHOOHCHCHO

15、OHOHHOADD雌 酚 酮雌 二 醇11-OH-ADD炔 雌 醇雌 三 醇COOHOCH2OHO泼 尼 松炔 雌 醚COOHOCH2OHHO泼 尼 松 龙OOCOOHOCH2OHHOFCH3倍 他 米 松COOHOCH2OHHOF OH确 炎 舒 松COOHOCH2OHHOFCH3CCH3COHCHCCH3O地 塞 米 松OO4ADOOOOHE s t r o n eOHOHCCHOHCCHOHOHOHOHADD乙 炔 雌 二 醇乙 炔 雌 二 醇甲 酯雌 二 醇雌 三 醇MeOOH卵 泡 激 素OO1 9 - 去 甲 乙 炔 睾 酮1 9 - 去 甲 雄 甾 - 4 - 烯 - 3 ， 1

16、 7 - 二 酮OOH蛋 白 同 化 激 素OHCCHO黄 体 激 素OOOOO螺 内 酯矿 质 皮 质 激 素OOH睾 酮OOHMe甲 基 睾 酮雄 激 素OMeH甲 基 雄 甾 烷 醇 酮蛋 白 同 化 激 素OHOOH氢 化 可 的 松其 它 高 档 皮 质 激 素CCH2OHO利用经过修饰的底物进行边链的选择性裂解利用经过修饰的底物进行边链的选择性裂解底物底物产物产物微生物微生物19-羟基甾醇羟基甾醇雌酮雌酮restrictus诺卡氏菌诺卡氏菌 ATCC 1488719-norsterols雌酮雌酮诺卡氏菌诺卡氏菌ATCC 191703-羟基羟基-19- 1，3，5 甾醇甾醇 雌酮雌酮

17、草分支杆菌草分支杆菌分支杆菌分支杆菌simplex节杆菌节杆菌IAM 166019-羟基羟基-4-胆甾烷胆甾烷-3-酮酮雌酮雌酮草分支杆菌草分支杆菌19-羟基羟基-胆甾醇胆甾醇-3- 乙酸盐乙酸盐雌酮雌酮草分支杆菌草分支杆菌19-羟基羟基- 4，7 甾醇甾醇3-羟基羟基-19-nor- 1，3，5（10）甾醇甾醇3-羟基羟基-19-nor- 1，3，5（10），），7（8）甾甾醇醇马烯雌酮马烯雌酮马萘雌酮马萘雌酮雌酮雌酮分支杆菌分支杆菌6-19-oxidosten-eones3-乙酸基乙酸基-5-氯（氟）氯（氟）-6-19-氧化氧化-甾醇甾醇6-19-氧化氧化-AD诺卡氏菌诺卡氏菌ATCC 1

18、9170分支杆菌分支杆菌 一些用于抑制环裂解的最为有效的抑制剂一些用于抑制环裂解的最为有效的抑制剂抑制剂名称抑制剂名称抑制机理抑制机理2,2-联吡啶联吡啶1,10-菲咯啉菲咯啉8-羟基羟基-喹啉喹啉5-硝基硝基-1,10-菲咯啉菲咯啉铜铁灵铜铁灵双硫腙双硫腙二苯基二硫缩二氨基脲二苯基二硫缩二氨基脲二乙基二硫氨基甲酸酯二乙基二硫氨基甲酸酯异烟酸酰肼异烟酸酰肼黄原酸黄原酸邻苯二氨邻苯二氨4-异戊酸环庚三烯酚酮异戊酸环庚三烯酚酮硫化四乙基秋兰姆硫化四乙基秋兰姆作为作为Fe2+的抑制剂的抑制剂Ni2+, Co2+, Pb2+, SeO32-, AsO2-用于取代铁离子或阻断用于取代铁离子或阻断SH-功

19、能功能亚甲蓝亚甲蓝刃天青刃天青正丙醇正丙醇氧化还原反应氧化还原反应在有在有酶抑酶抑制剂制剂存在存在的条的条件下件下进行进行甾醇甾醇边链边链的选的选择性择性裂解裂解 抑制剂抑制剂产物产物微生物微生物螯合剂螯合剂2,2-联吡啶联吡啶1,10-菲咯啉菲咯啉8-羟基羟基-喹啉喹啉ADADD其它雄甾烷衍生物其它雄甾烷衍生物Arthrobacter simplex 分支杆菌分支杆菌红球菌红球菌草分支杆菌草分支杆菌诺卡氏菌诺卡氏菌Arthrobacter globiformis 螯合剂和活性炭螯合剂和活性炭ADD分支杆菌分支杆菌 NRRL B-3683螯合剂和苯乙烯螯合剂和苯乙烯-二乙二乙烯苯共聚物烯苯共聚

20、物AD、ADD23,24-二去甲胆甾酸二去甲胆甾酸分支杆菌分支杆菌 NRRL B-3683螯合剂和脂肪、油、螯合剂和脂肪、油、甘油酯甘油酯ADD1-脱氢睾酮脱氢睾酮Arthrobacter simplex Brevibacterium lipolyticum草分支杆菌草分支杆菌无机离子无机离子AD、ADD其它雄甾烷衍生物其它雄甾烷衍生物分支杆菌分支杆菌 sp. KNGSF 70Arthrobacter simplex氧化还原颜料氧化还原颜料ADDArthrobacter simplex丙醇丙醇AD、ADD和其它衍和其它衍生物生物假单胞菌假单胞菌 sp. NCIBOOCorynespora-Ca

21、sicolaATCC 16718OOOH4-雄甾烯-3,17-反酮9 -羟基-4-雄甾烯-3,17-反酮O棒状杆菌ATCC 21329或短杆菌 NRRLB-8054OOH9 -羟基-3-氧化娠烷-4,17-反烯-20-羧酸COOHCOOH3-氧化娠烷-4,17-反烯-20羧酸OCH3O黑 根 霉Rhizopus N igricansA TCC 62276孕 酮11-羟 基 孕 酮（ 主 要 产 物 11,6 -二 羟 基 孕 酮（ 微 量 副 产 物 11还 原 孕 酮（ 偶 然 产 生 副 产 物 OCH3OOCH3OOCH3OHO+HOOHHHOOCH2OHO新月弯孢霉OCH2OHOOHHO147化合物S氢化可的松OCH2OHOOHHOF的瑰色链丝菌（Streptomyces roseoc